張憲偉 孫 杭

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京，210008）

自擬止瀉方通過(guò)調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞功能治療小兒遷延性腹瀉的臨床觀察

張憲偉 孫 杭

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京，210008）

目的：觀察自擬止瀉方對(duì)小兒遷延性腹瀉的臨床療效以及其部分調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。方法：將本院2010年3月至2013年3月100例延性腹瀉的患兒納入研究，對(duì)照組50例患兒接受內(nèi)科常規(guī)治療，觀察組50例在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上加用自擬止瀉方，觀察2組患兒均以10 d為1個(gè)療程，療程結(jié)束后觀察2組患兒臨床癥狀的變化，同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)患者血清中IL-6、IL-17、IL-23的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：1）2組患兒體溫恢復(fù)時(shí)間、嘔吐停止時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是觀察組患兒腹瀉停止時(shí)間短于對(duì)照組（P＜0.05）；2）治療后2組患兒血清中IL-6、IL-17、IL-23水平低于治療前（P＜0.05），治療1個(gè)療程后觀察組患者IL-17、IL-6、IL-23水平下降趨勢(shì)較對(duì)照組患兒明顯（P＜0.01）；3）隨訪3個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，觀察組患兒的體重增長(zhǎng)明顯高于對(duì)照組患兒（P＜0.05）。結(jié)論：遷延性腹瀉患兒存在Th17細(xì)胞表達(dá)增加，功能亢進(jìn)，自擬止瀉方可以明顯下調(diào)Th17細(xì)胞表達(dá)頻數(shù)及功能，該效應(yīng)可能是自擬止瀉方從機(jī)體免疫方面改善遷延性腹瀉的作用機(jī)制之一。

遷延性腹瀉；自擬止瀉方；Th17細(xì)胞；IL-6；IL-17；IL-23

感染性腹瀉是屬于世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其以大便次數(shù)以及大便性狀的改變?yōu)橹饕R床癥狀，其中小兒是腹瀉的主要發(fā)病人群，如果急性腹瀉無(wú)法得到及時(shí)、合理的治療將即為可能轉(zhuǎn)變?yōu)檫w延性腹瀉，造成兒童的營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、免疫功能低下等，影響生活質(zhì)量［1-3］。隨著目前臨床抗生素的濫用，細(xì)菌耐藥性現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，且由于各類(lèi)西藥都可能產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)導(dǎo)致患兒無(wú)法耐受，所以，探尋更安全有效的遷延性腹瀉治療方案尤其重要，中藥湯藥的治療價(jià)值逐漸受到重視。從中醫(yī)學(xué)角度認(rèn)為遷延性腹瀉乃先天不足，后天調(diào)護(hù)失宜，病后體弱，以致脾胃虛弱，不能升清降濁谷反成滯，水反為濕，合污下降而成，本院根據(jù)上述病機(jī)自擬止瀉方予患兒口服，療效顯著，但其治療機(jī)制尚未清楚。

CD4+T細(xì)胞是免疫反應(yīng)以及炎性反應(yīng)性疾病的重要調(diào)節(jié)者，遇到特異性抗原后，他們被激活并增殖分化為不同的效應(yīng)T細(xì)胞亞群，如Th1型輔助細(xì)胞（Th1）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，Th2細(xì)胞及產(chǎn)生白細(xì)胞介素17（IL-17）的T輔助17型細(xì)胞（Th17細(xì)胞）則促進(jìn)炎性反應(yīng)進(jìn)程。已有文獻(xiàn)表明在腹瀉患者中存在Treg細(xì)胞比率降低，Th17細(xì)胞比率升高的TregTh17失衡［4-6］，但Th17細(xì)胞及其相關(guān)作用因子IL-6、IL-17、IL-23在疾病過(guò)程中發(fā)揮的作用尚未明確。于是我們假設(shè)，小兒遷延性腹瀉與機(jī)體免疫功能存在密切聯(lián)系，那此病的發(fā)生發(fā)展是否與Th17細(xì)胞功能相關(guān)，而自擬止瀉方是否通過(guò)該途徑發(fā)揮作用，本研究擬通過(guò)檢測(cè)自擬止瀉方對(duì)于遷延性腹瀉患兒治療前后Th17細(xì)胞及其相關(guān)作用因子IL-17、IL-6、IL-23的表達(dá)變化進(jìn)一步闡明Th17細(xì)胞及其作用因子IL-17、IL-6、IL-23在遷延性腹瀉中發(fā)揮的作用并探討自擬止瀉方對(duì)Th17細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 將本院2010年3月至2013年3月100例延性腹瀉的患兒納入研究，所有入組患兒診斷均符合2008年出版的全國(guó)高等醫(yī)學(xué)教材中關(guān)于中國(guó)腹瀉病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。100例患兒根據(jù)入院順序隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，對(duì)照組50例，男27例，女23例，年齡7個(gè)月至5歲，平均（2±0.8）歲，大便次數(shù)3～12次d，平均（6±1.7）次；觀察組50例，男29例，女21例，年齡6個(gè)月至4.5歲，平均（2±0.8）歲，大便次數(shù)4～11次d，平均（5±2.1）次。2組患兒在年齡、性別、每日大便次數(shù)等方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究方案經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象家屬均知情同意。

1.2 治療方法 所有患兒均接受內(nèi)科常規(guī)治療，均以去乳糖配方奶飲食，有脫水癥狀的患兒予補(bǔ)液糾正，思密達(dá)口服［蒙脫石散，國(guó)藥準(zhǔn)字H20000690博福-益普生（天津）制藥有限公司，3 g袋］，1歲以下，1袋日；1～2歲，1～2袋d；2歲以上，2～3袋d，均分三次服用。觀察組患兒在上述治療方案基礎(chǔ)上加服本院自擬止瀉方，具體方藥如下：黃芪20 g，炒白術(shù)9 g，防風(fēng)6 g，山藥6 g，干姜6 g，肉豆蔻6 g，甘草3 g，水煎藥方100 m L，1劑d（早晚分服）。

1.3 觀察指標(biāo) 臨床癥狀改善情況：2組患兒體溫恢復(fù)時(shí)間、嘔吐停止時(shí)間、Th17細(xì)胞水平的變化、IL-6、IL-17、IL-23濃度變化。

1.4 主要試劑與儀器 RPMI 1640和胎牛血清（美國(guó)Thermo公司）；人淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；佛波酯（PMA）、離子霉素（Ion）、莫能菌素（Mon）、破膜劑、CD4-FITC、IL-17AAPC流式抗體、人細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-23 ELISA試劑盒（美國(guó)eBioscience公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo labsystem公司）；BD FACSVerseTMSystem（美國(guó)BD Biosciences公司）。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 Th17細(xì)胞檢測(cè) 取患兒治療前后前臂外周抗凝血5 mL，用人淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單核細(xì)胞（PBMC，1×106mL）200μL，置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，加入刺激劑佛波醇乙酯（PMA）及離子霉素、莫能霉素等工作液并混勻，置于37℃，5%CO2。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h。用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，離心收集細(xì)胞，加人5μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD4（CD4-FITC）、5μL藻紅蛋白標(biāo)記的IL-17（IL-17A-APC），操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞。

1.5.2 細(xì)胞因子檢測(cè) 取從患兒治療前后前臂外周血2 mL置入肝素鈉抗凝管內(nèi)，以3 000 rmin高速離心后，取上清液置于-80℃冰箱保存，按照IL-6、IL-17、IL-23 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0和Graph-Pad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組數(shù)據(jù)的比較先進(jìn)行Shapiro-Wilk tes t檢驗(yàn)正態(tài)性和Levene tes t檢驗(yàn)方差齊性。若兩者都符合，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多樣本均數(shù)間的兩兩比較。若有至少一項(xiàng)不符合，則采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)和Dunn's多重檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以α＝0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患兒臨床癥狀比較 2組患兒體溫恢復(fù)時(shí)間、嘔吐停止時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是觀察組患兒腹瀉停止時(shí)間與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表1。

2.2 自擬止瀉方顯著抑制遷延性腹瀉患兒外周血中Th17細(xì)胞的表達(dá) 對(duì)不同組患兒外周血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-17+結(jié)果顯示：觀察組治療后CD4+IL-17+T細(xì)胞百分率（0.895±0.309）%，顯著低于治療前［（0.895±0.309）%vs（2.556±0.491）%，｜t｜＝22.07，P＝0.000 8＜0.001］及對(duì)照組治療后［（0.895 ±0.309）%vs（1.262±0.247）%，｜t｜＝3.676，P＝0.009＜0.01］，見(jiàn)圖1，自擬止瀉方可以顯著降低抑制遷延性腹瀉患兒外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)。

表1 2組患兒臨床癥狀比較（±s）

表1 2組患兒臨床癥狀比較（±s）

注：與觀察組比較，*P＜0.05。

組別例數(shù)體溫恢復(fù)時(shí)間（d）嘔吐停止時(shí)間（d）腹瀉停止時(shí)間（d）觀察組50 1.88±0.92 2.23±0.44 5.61±1.26對(duì)照組50 1.83±0.84 2.30±0.18 7.56±1.73*P 0.08 0.09 0.02 t 3.54 4.79 3.91

圖1 2組患兒外周血中CD4、IL-7+T細(xì)胞百分率變化

2.3 自擬止瀉方能顯著抑制遷延性腹瀉患兒血清中Th17細(xì)胞功能細(xì)胞因子的表達(dá) 治療后2組患兒血清中IL-6、IL-17、IL-23水平低于治療前（P＜0.05），治療1個(gè)療程后觀察組患者IL-17、IL-6、IL-23水平下降趨勢(shì)較對(duì)照組患兒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；見(jiàn)表2。

表2 2組指標(biāo)變化比較（±s）

表2 2組指標(biāo)變化比較（±s）

注：與治療前相比，*P＜0.05；與對(duì)照組相比，△P＜0.05。

組別IL-6（μgL）IL-17（μgL）IL-23（μgL）觀察組治療前22.89±0.93 34.65±0.71*39.65±2.40治療后9.31±0.31*△10.69±0.08*△14.92±1.76*△對(duì)照組治療前23.03±0.81 34.94±0.92*38.44±2.17治療后16.92±0.41*5.91±0.20*25.28±1.31*

3 討論

遷延性腹瀉是造成兒童嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、發(fā)育不全、免疫力低下的主要原因，本研究2組患兒的體溫恢復(fù)時(shí)間、嘔吐停止時(shí)間雖然相近，但是加用自擬止瀉湯的患兒腹瀉停止時(shí)間短于常規(guī)治療組患兒，說(shuō)明可將自擬止瀉湯做為治療遷延性腹瀉的主要輔助手段。由于遷延性腹瀉發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，患兒機(jī)體免疫病理?yè)p傷在發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮主要作用，免疫系統(tǒng)紊亂及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡是遷延性腹瀉重要的致命因素之一，因此，糾正遷延性腹瀉患者的免疫調(diào)節(jié)紊亂及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡具有重大的防治意義，而外周血T細(xì)胞亞群是反映遷延性腹瀉免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)［7-8］。筆者根據(jù)這一思路，希望從外周血T細(xì)胞亞群的功能變化探討自擬止瀉湯的作用機(jī)制。

Th17細(xì)胞是與Thl、Th2的CD4+T細(xì)胞亞群不同的新發(fā)現(xiàn)細(xì)胞，有文獻(xiàn)證實(shí)：Th17細(xì)胞可能擔(dān)負(fù)著調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫和炎性反應(yīng)的角色，多數(shù)遷延性腹瀉患兒存在機(jī)體免疫功能異常以及消化道炎性反應(yīng)，由于炎性反應(yīng)因子（IL-6）的存在，幼稚的CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞，并產(chǎn)生其主要效應(yīng)因子是IL-17，而IL-17已被證實(shí)是一種促炎因子，其與受體結(jié)合后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種炎性反應(yīng)因子，如IL-23等，影響機(jī)體免疫應(yīng)答，所以Th17細(xì)胞分化和免疫功能的調(diào)控研究具有重要的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用價(jià)值［9-15］。本研究通過(guò)觀察2組患兒血清中Th17細(xì)胞的數(shù)量及功能，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)治療后2組患兒外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)頻率均較治療前降低，考慮遷延性腹瀉發(fā)生時(shí)，大量Th17細(xì)胞被活化，通過(guò)分泌IL-6、IL-17、IL-23來(lái)招募中性粒細(xì)胞細(xì)胞等參與腸道炎性反應(yīng)過(guò)程，而自擬止瀉方逆轉(zhuǎn)此過(guò)程，明顯降低Th17細(xì)胞表達(dá)頻率及IL-6、IL-17、IL-23濃度，因此糾正了患兒的臨床癥狀。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為遷延性腹瀉是先天不足，后天調(diào)護(hù)失宜，病后體弱，以致脾胃虛弱，不能升清降濁谷反成滯，水反為濕，合污下降導(dǎo)致而成，本院自擬止瀉方重用黃芪、白術(shù)，取兩味藥在益氣升脾的基礎(chǔ)上促進(jìn)脾胃運(yùn)化，藥理研究證實(shí)黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗菌作用。防風(fēng)入脾經(jīng)，質(zhì)輕，可引導(dǎo)水谷之氣上升，山藥性平和，歸肺、脾、腎三經(jīng)，主要功效為補(bǔ)脾止瀉，藥理研究顯示山藥可改善消化，調(diào)節(jié)自主神經(jīng)，增強(qiáng)體質(zhì)；遷延性腹瀉患兒由于久泄傷陽(yáng)，予加干姜溫中澀腸止瀉；肉豆蔻，除寒燥濕，解結(jié)行氣，專理脾胃，能固及大腸之滑脫；甘草予調(diào)和諸藥藥性。諸藥合用，攘外安內(nèi)，療效顯著。本研究顯示，觀察組患者Th17細(xì)胞表達(dá)頻率，IL-6、IL-17、IL-23細(xì)胞因子的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，提示自擬止瀉方可能具有下調(diào)Th17細(xì)胞功能，改善慢性炎性反應(yīng)的作用，該效應(yīng)可能是自擬止瀉方從機(jī)體免疫方面改善遷延性腹瀉患兒的作用機(jī)制之一。

總之，遷延性腹瀉的發(fā)病機(jī)制與Th17細(xì)胞功能失調(diào)密切相關(guān)，而自擬止瀉方可以部分逆轉(zhuǎn)該疾病的發(fā)展，從而改善患者預(yù)后?？紤]可能此次入選樣本量較小有關(guān)，隨訪時(shí)間不長(zhǎng)等，故有待于增加樣本量，進(jìn)一步擴(kuò)大研究予以證實(shí)自擬止瀉方對(duì)于遷延性腹瀉的預(yù)后及確切機(jī)制，為指導(dǎo)臨床治療提供參考價(jià)值。

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（2014-07-14收稿 責(zé)任編輯：徐穎）

Clinical Observation on Self-Made Antidiarrheal Decoction in Treating Pediatric Protracted Diarrhea by Regulating Th17 Cell Function

Zhang Xianwei，Sun Hang
（Laboratory，Nanjing Children's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210008，China）

Objective：To observe the clinical curative effect of self-made antidiarrheal decoction in the treatment of pediatric protracted diarrhea and some of its regulatory mechanism.Methods：One hundred cases of pediatric protracted diarrhea treated in our hospital during March 2010 to March 2013 were included in the study.Fifty cases in the control group accepted medical conventional treatment，and the other 50 cases in the observation group received self-made antidiarrheal decoction apart from the same treatment of the control group. The treatment course of both groups was 10 days.The symptoms changes of children in the two groups after treatment was observed.Simultaneously flow cytometry was used to test peripheral blood expression level of Th17 cells，and ELISA was used to detect the protein expression level of IL-6，IL-17，IL-23 in the serum of patients.Results：1）Temperature recovery time，vomiting stop time of the two groups were with no statistical differences（P＞0.05），but the diarrhea stop time of the observation group was shorter than that of the control group（P＜0.05）.2）after treatment，serum IL-6，IL-17，IL-23 levels in children in the two groups with lower than those before treatment（P＜0.05），and after one period of treatment，IL-17，IL-6，IL-23 levels of the observation group declined significantly than those of the control group（P＜0.01）.3）after the 3months follow-up，children's weight gain of the observation group was obviously more than that of the control group（P＜0.05）.Conclusion：Children with protracted diarrhea have increased expression of Thl7 cells and hyperfunction，and self-made antidiarrheal decoction can obviously down-regulate frequency and function of Thl7 cells expression which may be one of the mechanisms of self-made antidiarrheal decoction improving protracted diarrhea in the aspects of the body's immune ability.

Protracted diarrhea；Self-made antidiarrheal decoction；Th17 cells；IL-6；IL-17；IL-23

R285.6

A

10.3969j.issn.1673-7202.2014.12.014

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃立項(xiàng)（編號(hào)：2011KYB142）