陳 璇 袁 茵 邵紅偉 盧志毅 張柳華 黃樹林

（廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生物制藥研究所廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)正常人淋巴細(xì)胞各亞群比例的影響①

陳 璇 袁 茵②邵紅偉 盧志毅 張柳華 黃樹林

（廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生物制藥研究所廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

目的:研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）培養(yǎng)上清對(duì)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）活化、生存及其各淋巴細(xì)胞亞群比例的影響。方法:通過(guò)密度梯度離心法分離PBMC，加入OKT3刺激，用含有hUC-MSCs培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基（MSC-CM）處理PBMC，流式細(xì)胞術(shù)分析比較處理組和對(duì)照組各淋巴細(xì)胞亞群比例的變化，ELISA法檢測(cè)MSC-CM對(duì)PBMC分泌IFN-γ、IL-10的影響，Annexin V/PI雙染確定活化PBMC的凋亡情況。結(jié)果:MSC-CM下調(diào)了CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，上調(diào)了PBMC中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的含量，而對(duì)其他淋巴細(xì)胞亞群的比例無(wú)顯著影響;MSC-CM抑制了PBMCs分泌IFN-γ的能力，但對(duì)IL-10的分泌有促進(jìn)作用;此外，MSC-CM對(duì)PBMCs有保護(hù)作用，降低了PBMC在OKT3刺激下的凋亡程度。結(jié)論:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能可不依賴于與免疫細(xì)胞的直接或間接接觸，并且與誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)，促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖和活化可能是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮其免疫抑制功能的途徑之一。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞;免疫調(diào)節(jié)

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）廣泛存在于多種組織，具有自我更新和多向分化潛能，并具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，是細(xì)胞治療領(lǐng)域理想的種子細(xì)胞［1］。目前，在MSCs的臨床以及基礎(chǔ)研究中廣泛使用的是骨髓來(lái)源的MSCs（BMMSCs）。骨髓的來(lái)源有限，取樣時(shí)要進(jìn)行侵襲性操作，而且隨著供體年齡增長(zhǎng)骨髓中MSCs的數(shù)量急劇下降，使其應(yīng)用受到了限制［2］。人臍帶組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）取材方便，無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議，增殖能力更強(qiáng)，能連續(xù)多次傳代后仍保持干細(xì)胞特性，已成為BM-MSCs的良好替代物。

間充質(zhì)干細(xì)胞能夠調(diào)控體內(nèi)多種免疫細(xì)胞的活化和功能，具有廣泛的免疫抑制效應(yīng)，在自身免疫性疾病和移植物抗宿主?。℅VHD）的臨床治療中有潛在的應(yīng)用價(jià)值［3，4］。因此，有關(guān) MSCs免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制的研究已成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前對(duì)于骨髓源MSCs免疫特性的研究比較充分，而臍帶源MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的研究則相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)主要研究了hUC-MSCs培養(yǎng)上清對(duì)淋巴細(xì)胞活化、生存及其各亞群比例的影響，旨在明確 hUCMSCs是否具有固有的分泌性免疫調(diào)節(jié)功能，探究在hUC-MSCs免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的免疫細(xì)胞，為人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司，人淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰井a(chǎn)品，鼠抗人CD3-PE-Cy5、CD4-PE、CD8-PC7、CD19-ECD、CD16-FITC、CD56-PE、CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE等熒光標(biāo)記抗體購(gòu)自Beckman Coulter公司，細(xì)胞因子 IFN-γ、IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，Annexin VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為MBL公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞由本室分離和鑒定［5］，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基中，取P3～P8代hUC-MSCs的培養(yǎng)上清用于實(shí)驗(yàn)。具體方法為:將1.5×106個(gè)hUC-MSCs細(xì)胞接種于10 cm塑料培養(yǎng)皿，加入10 ml DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后（約80%融合）收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，0.22μm濾膜過(guò)濾，4℃保存，1周內(nèi)使用。用于培養(yǎng)PBMC的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（MSCCM）的配方為:hUC-MSCs培養(yǎng)上清:DMEM/F12培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）=3∶2，臨用前配制。

使用淋巴細(xì)胞分離液從健康成年人外周血中分離PBMC。取等量的同一供者PBMC，分別以MSCCM和DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)體系中含1 000 U/ml的人重組IL-2和50 ng/m l OKT3，5 d后收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清用于ELISA檢測(cè)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞各亞群比例 離心收集對(duì)照組PBMC和MSC-CM處理組PBMC，加入PBS洗滌1次，按2×105細(xì)胞/管加入流式管，根據(jù)每一種淋巴細(xì)胞免疫表型檢測(cè)的需要，設(shè)置相應(yīng)的空白對(duì)照、同型對(duì)照、單色熒光補(bǔ)償對(duì)照以及單色或多色標(biāo)記的待測(cè)樣本，加入對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育30min，洗滌2次，最后用500μl PBS重懸細(xì)胞，上BECKMAN COULTER Gallios流式細(xì)胞儀檢測(cè)B細(xì)胞、T細(xì)胞以及NK細(xì)胞的含量，使用FlowJo軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)照組PBMC和MSC-CM處理組PBMC各1×105個(gè)，用PBS洗滌1次，每管加85μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，最后向每管中加400μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀測(cè)定兩組PBMC的細(xì)胞凋亡情況。

1.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子分泌 取對(duì)照組PBMC和MSC-CM處理組PBMC的培養(yǎng)上清，過(guò)濾除去上清中殘留的細(xì)胞，另取在CO2培養(yǎng)箱中同步培養(yǎng)的同批次無(wú)細(xì)胞DMEM/F12培養(yǎng)基和MSC-CM作為空白對(duì)照，以上4組分別按100μl/孔加入到預(yù)包被有IFN-γ抗體或IL-10抗體的酶標(biāo)板孔內(nèi)，每組3復(fù)孔，采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定各孔在450 nm處的OD值，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism軟件進(jìn)行處理，以x－±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)（t檢驗(yàn)前先做兩樣本的方差齊性檢測(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞各亞群比例測(cè)定 通過(guò)單色或多色免疫熒光染色流式細(xì)胞術(shù)分析PBMC中淋巴細(xì)胞各亞群的含量，分別測(cè)定了CD19+B淋巴細(xì)胞、CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、CD3－CD16+CD56+NK細(xì)胞在兩組PBMC中的比例以及兩組PBMC中CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞的比值。通過(guò)比較得知，對(duì)照組PBMC和MSC-CM處理組PBMC的CD19+B淋巴細(xì)胞、CD3+T淋巴細(xì)胞和CD3－CD16+CD56+NK細(xì)胞的含量均無(wú)顯著性差異，而 MSC-CM處理組 PBMC的 CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性 T淋巴細(xì)胞含量高于對(duì)照組，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1和圖1。

2.2 IFN-γ和IL-10的分泌水平 通過(guò)ELISA法分別檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)組PBMC和MSC-CM處理組PBMC分泌IFN-γ和IL-10的情況。結(jié)果顯示，在OKT3刺激下，與對(duì)照組相比，經(jīng)MSC-CM處理的PBMC分泌IFN-γ的能力下降，但分泌IL-10的能力增強(qiáng)，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

2.3 PBMC凋亡率的改變 對(duì)照組PBMC和MSC-CM處理組PBMC體外培養(yǎng)5 d時(shí)的自發(fā)凋亡情況見(jiàn)圖2。從流式圖中可以看出，MSC-CM處理組PBMC發(fā)生早期凋亡（Annexin V+PI－，右下象限）和晚期凋亡（Annexin V+PI+，右上象限）的細(xì)胞均少于對(duì)照組;相應(yīng)地，MSC-CM處理組PBMC的活細(xì)胞比例則顯著高于對(duì)照組。上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

表1 hUC-M SCs培養(yǎng)上清對(duì)淋巴細(xì)胞各亞群比例的影響±s）Tab.1 Effect of hUC-MSC supernatant on subgroup proportions in lym phocytes± s）

表1 hUC-M SCs培養(yǎng)上清對(duì)淋巴細(xì)胞各亞群比例的影響±s）Tab.1 Effect of hUC-MSC supernatant on subgroup proportions in lym phocytes± s）

Note:1）P ＜0.01;2）P ＜0.05.

Cell proportion（%）+CD19+ CD3+ CD4+CD25+CD127low CD3－CD16+CD56+ CD3+CD4+/CD3+CD8 PBMC in DMEM-F12 6.15 ±1.15 69.63 ±12.97 3.16 ±0.37 7.88 ±5.71 1.63 ±0.40 PBMC in MSC-CM 5.33 ±0.64 69.07 ±14.15 5.43 ±0.721） 6.44 ±5.74 0.67 ±0.262）

圖1 hUC-MSCs培養(yǎng)上清作用下淋巴細(xì)胞各亞群比例變化的流式檢測(cè)Fig.1 Representative flow cytometric analysis of subgroup proportions in PBMC treated w ith conditioned medium of hUC-MSCs

圖3 hUC-M SCs培養(yǎng)上清降低活化PBMC的凋亡程度Fig.3 hUC-MSCs protect activated PBMC from apoptosis

圖2 hUC-MSCs培養(yǎng)上清作用下PBMC分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10 的變化Fig.2 Secretion levels of IFN-γ and IL-10 by PBMC cultured in DMEM/F12 medium and in MSC-CM

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能，能在體內(nèi)外發(fā)揮免疫抑制作用，包括抑制同種異體PBMC誘導(dǎo)的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的增殖以及抑制樹突細(xì)胞（DC）的成熟［6，7］。有研究證明，骨髓來(lái)源的MSCs（BM-MSCs）對(duì)于異基因造血干細(xì)胞移植后發(fā)生的急性頑固性移植物抗宿主病具有良好的臨床治療效果［8］，在同種異體移植耐受誘導(dǎo)方面具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。與BM-MSCs的低免疫原性相似，hUC-MSCs不表達(dá)HLA-DR或共刺激分子，不能激活異源PBMC的增殖反應(yīng)［9］，也可用于異基因移植。此外，hUC-MSCs還具有來(lái)源充足、無(wú)痛取樣、微生物感染幾率低和擴(kuò)增性好等優(yōu)點(diǎn)，臍帶組織在人類胚胎發(fā)育中的特殊地位和作用也為hUCMSCs帶來(lái)了更潛在的優(yōu)勢(shì)。

本文用含有hUC-MSCs獨(dú)立培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基處理OKT3刺激的PBMC，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)處理組PBMC分泌IFN-γ的水平明顯低于未處理組。IFN-γ的分泌水平是表征PBMC活化程度的標(biāo)志之一。因此，我們的結(jié)果不僅證實(shí)hUC-MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也反映出hUC-MSCs不依賴于細(xì)胞直接接觸而發(fā)揮其免疫抑制功能的特點(diǎn)。盡管有報(bào)道認(rèn)為MSCs需要與靶細(xì)胞發(fā)生直接接觸才能發(fā)揮免疫抑制作用［10］，但大多數(shù)的研究仍然表明，MSCs的免疫抑制作用主要還是通過(guò)可溶性細(xì)胞因子的釋放而實(shí)現(xiàn)的［11］。

已報(bào)道的由MSCs分泌并介導(dǎo)免疫抑制的可溶性因子有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor，HGF）［11］、白介素 2（Interleukin-2，IL-2）和 IL-10［12］、2，3-吲哚胺雙加氧酶（IDO）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）以及前列腺素 E2（PGE2）［13］。因此，除了直接接觸以外，在Transwell實(shí)驗(yàn)中，MSCs仍可抑制絲裂原激活的PBMC增殖和IFN-γ的分泌，其免疫抑制效應(yīng)持續(xù)不變［13］。但在間充質(zhì)干細(xì)胞是否天生就具有免疫抑制能力這一問(wèn)題上，有人提出MSCs的免疫抑制功能是在受到活化的免疫細(xì)胞所分泌的炎癥因子刺激后才表現(xiàn)出來(lái)的，而并非天生固有的［14］。這種觀點(diǎn)與Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不矛盾，因?yàn)橛肨ranswell將MSCs與PBMC分隔并不能阻止兩者之間通過(guò)可溶性因子進(jìn)行動(dòng)態(tài)的信號(hào)交換。而本文使用的是處于獨(dú)立培養(yǎng)狀態(tài)的MSCs培養(yǎng)上清，在用于處理PBMC之前并未與其發(fā)生過(guò)任何直接或間接的接觸，卻仍可抑制PBMC分泌IFN-γ，這提示hUC-MSCs可能具有固有的分泌型免疫抑制能力。

本文進(jìn)一步研究了hUC-MSCs上清對(duì)PBMC各淋巴細(xì)胞亞群比例的影響。我們的數(shù)據(jù)顯示，含有hUC-MSCs上清的條件培養(yǎng)基（MSC-CM）下調(diào)了CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值，使 CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的比例發(fā)生了上調(diào)，但對(duì)其他淋巴細(xì)胞亞群無(wú)顯著影響。不僅如此，MSC-CM還促進(jìn)了PBMC的IL-10分泌水平。Treg是機(jī)體發(fā)揮免疫抑制功能的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)細(xì)胞，在體內(nèi)的主要作用是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，防止免疫反應(yīng)無(wú)限制擴(kuò)大及抑制自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。Treg細(xì)胞能夠抑制CD4+CD25－T細(xì)胞的增殖活化，抑制NK細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒作用，以及抑制B細(xì)胞的免疫活性［15］。IL-10是Treg細(xì)胞發(fā)揮其免疫抑制功能的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，Treg通過(guò)分泌IL-10抑制Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、Th2介導(dǎo)的抗體產(chǎn)生和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化［16］。因此，本文的結(jié)果表明，hUC-MSCs不僅使Treg細(xì)胞在數(shù)量上發(fā)生了擴(kuò)增，可能還對(duì)Treg細(xì)胞的活化和功能有促進(jìn)作用，Treg細(xì)胞可能是hUC-MSCs發(fā)揮免疫抑制作用的重要效應(yīng)細(xì)胞。

CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞的比值是判斷機(jī)體免疫狀態(tài)的敏感指標(biāo)，它的下降提示機(jī)體免疫功能低下或處于免疫抑制狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs上清在使 Treg細(xì)胞比例增加的同時(shí)，還下調(diào)了CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞的比值，這進(jìn)一步證明了hUC-MSCs所具有的免疫抑制功能。由于Treg細(xì)胞能夠抑制CD4+T淋巴細(xì)胞亞群中起主要免疫效應(yīng)的輔助性T細(xì)胞的活化增殖和細(xì)胞因子分泌［17］，因此，本文推測(cè)hUC-MSCs上清引起的Treg細(xì)胞增加與CD4+/CD8+比值下降之間可能存在一定的關(guān)系，即:Treg細(xì)胞可能通過(guò)抑制CD4+T淋巴細(xì)胞主要亞群的增殖，進(jìn)而影響CD4+T淋巴細(xì)胞的整體含量，并導(dǎo)致CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞的比值的下降。

本研究還發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs培養(yǎng)上清對(duì)活化的PBMC有保護(hù)作用，能降低PBMC在OKT3刺激下的凋亡程度，從而證明hUC-MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮與誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)。目前文獻(xiàn)中關(guān)于MSCs影響免疫細(xì)胞凋亡的認(rèn)識(shí)仍存在分歧，有報(bào)道認(rèn)為MSCs通過(guò)啟動(dòng)活化T細(xì)胞的早期凋亡而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［18］，但是后期也有 MSCs保護(hù) T細(xì)胞、使其免于凋亡的報(bào)道［19］。本研究的數(shù)據(jù)證明hUC-MSCs能夠抑制免疫細(xì)胞凋亡而不是誘導(dǎo)凋亡，與Benvenuto等［19］的報(bào)道相一致。

綜上所述，本文通過(guò)將獨(dú)立培養(yǎng)的hUC-MSCs培養(yǎng)上清作用于活化的PBMC，發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs可通過(guò)分泌可溶性因子抑制免疫反應(yīng)，其免疫抑制功能的發(fā)揮可不依賴于與免疫細(xì)胞的直接或間接接觸，也不會(huì)加劇免疫細(xì)胞的凋亡，并且證實(shí)促進(jìn)Treg細(xì)胞的擴(kuò)增和活化可能是hUC-MSCs發(fā)揮其免疫抑制功能的途徑之一，為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床免疫治療中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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［收稿2013-10-25 修回2013-12-23］

（編輯 張曉舟）

Influence of supernatant from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on proportions of each human lym phoid subgroup

CHENXuan，YUANYin，SHAOHong-Wei，LUZhi-Yi，ZHANGLiu-Hua，HUANGShu-Lin.GuangdongProvincialKey LaboratoryofBiotechnologyCandidateDrugResearch，DepartmentofLifeScienceandBiologicalPharmacy，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China

Objective:To investigate the impact of human umbilical cord-derivedmesenchymal stem cells on the activation，the survival of human peripheral blood mononuclear cell（hPBMC）and the proportions of each human lymphoid subgroup.Methods:PBMC were isolated from healthy donors by density gradient centrifugation，then cultured in MSC-CM as treatment group after being activated by OKT3.Each lymphoid subgroup proportion was analyzed by flow cytometry to observe the difference between treatment and control group.The effect ofMSC-CM on activated PBMC for the production of IFN-γ and IL-10 were tested by ELISA.The level of apoptosis was assessed by flow cytometrywith Annexin-V/PIas fluorescentmarker.Results:Compared with the controlgroup，MSC-CM down-regulated the ratio of CD4+T cell to CD8+T cell，and increased the proportion of CD4+CD25+CD127lowTreg cell，thus other subgroup had no significantdifference.MSC-CM inhibited the production of IFN-γ by PBMC，but promoted the secretion of IL-10，and protected PBMCs from apoptosiswhen activated with OKT3.Conclusion:hUC-MSCmay play a role of immunosuppression by promoting the proliferation and activation of Treg cell.This kind of inhibitory activity is neither relied director indirect contactwith the lymphocytes，nor influenced by inducing immune cells apoptosis.

Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells;Regulatory T cells;Immunomodulation

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.001

①本文受國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2009ZX09103-708）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31100664，31300737，81303292）和廣東省自然科學(xué)基金（S2012040007958）資助。

②并列第一作者。

陳 璇（1988年－），女，主要從事腫瘤免疫治療研究，E-mail:cissy09.angel@163.com。

及指導(dǎo)教師:黃樹林（1953年－），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail:shulhuang@sina.com。

R392.9

A

1000-484X（2014）05-0577-05