張志雯，秦素平，陳于和，喬亞科，武寶悅

(河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院, 河北 秦皇島，066600)

D.Harman提出的自由基衰老學(xué)說認(rèn)為，機(jī)體衰老與體內(nèi)自由基增多有關(guān)，自由基能從多方面對(duì)機(jī)體造成損傷，加速機(jī)體衰老[1～3]。自由基過多或清除過慢，還會(huì)誘發(fā)各種疾病[4～6]。隨著人們對(duì)生活質(zhì)量的要求不斷提高和綠色環(huán)保消費(fèi)意識(shí)的增強(qiáng)，天然的清除自由基的活性物質(zhì)的研究，特別是將其應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健品和化妝品等行業(yè)，日益成為研究的熱點(diǎn)[7～10]。甘薯不僅具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)還含有多種生物活性物質(zhì)，具有獨(dú)特的生理保健作用和藥用價(jià)值，倍受國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注[11～14]，關(guān)于其清除自由基活性物質(zhì)的研究也有不少報(bào)道，其清除自由基的活性物質(zhì)有多糖、多酚等[15～17]。目前針對(duì)清除特定自由基活性物質(zhì)的研究還少有報(bào)道。由于自由基種類繁多而且代謝過程非常復(fù)雜[18，19]，針對(duì)不同的自由基，尋找特定的清除劑有利于提高自由基的清除率。

筆者分別針對(duì)清除羥自由基和超氧陰離子自由基的兩類不同的活性物質(zhì)，探討了溶劑、提取溫度、提取時(shí)間和提取劑用量對(duì)其自由基清除率的影響，以獲取最佳的提取工藝條件，為羥自由基清除劑和超氧陰離子自由基清除劑的開發(fā)利用以及更好地利用甘薯中的活性物質(zhì)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

盧選1號(hào)甘薯，為本課題組引種保存。

1.2 方法

1.2.1甘薯中清除自由基活性成分的提取 甘薯→洗凈→去皮→切片→烘干至恒質(zhì)量→粉碎→過篩(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)篩,篩孔尺寸0.5 mm，)得到甘薯粉，分別稱取0.2 g甘薯粉放入試管，加入不同的提取溶劑進(jìn)行提取，提取上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2羥自由基清除率的測(cè)定 參照洪宗國(guó)等[20]的方法，略有改動(dòng)。在試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，不同的提取液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min；再加入6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻，靜置30 min后，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)。清除率計(jì)算公式如下：

清除率=[(A空白-A樣品+A校正)/A空白]×100%

式中：A空白為空白對(duì)照液的吸光度值，A樣品為加入樣品提取液后的吸光度值，A校正為不加顯色劑H2O2樣品提取液本底的吸光度值。

1.2.3超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定 參照洪宗國(guó)等[20]的方法，略有改動(dòng)。取50 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL和不同的提取液0.1 mL，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min。加入25 ℃水浴中預(yù)熱的2.5 mmol/L的鄰苯三酚0.4 mL，混勻后置于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，立即加入8.0 mol/L的HCl 0.1 mL終止反應(yīng)。用去離子水調(diào)節(jié)儀器的零點(diǎn)，于320 nm處測(cè)定吸光度值?？瞻捉M以0.1 mL去離子水代替樣品。清除率計(jì)算公式如下：

清除率=[(A空白-A樣品+A校正)/A空白]×100%

式中：A空白為空白對(duì)照液的吸光度值，A樣品為加入樣品提取液后的吸光度值，A校正為不加顯色劑H2O2樣品提取液本底的吸光度值。

1.2.4數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)用DPS(v7.05版)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除羥自由基的活性物質(zhì)提取條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的確定 分別以體積分?jǐn)?shù)為0(水)，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00(無水乙醇)的乙醇作為提取溶劑，在提取溫度為40 ℃，提取劑用量30 mL/g條件下，提取時(shí)間3 h。結(jié)果表明：隨著提取溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷升高，提取液對(duì)羥自由基的清除率呈逐漸下降趨勢(shì)(圖1)；當(dāng)以水作為提取溶劑時(shí)，提取液對(duì)羥自由基的清除率最高。所以，清除羥自由基活性物質(zhì)的提取采用水作提取溶劑為最佳。

2.1.2溫度對(duì)清除率的影響 以水為提取溶劑，提取劑用量30 mL/g，分別在20，40，60，80，100 ℃條件下提取3 h。結(jié)果表明：當(dāng)提取溫度低于40 ℃時(shí)，提取液對(duì)羥自由基的清除率隨溫度升高而升高(圖2)；40 ℃時(shí)清除率最高；當(dāng)提取溫度高于40 ℃后，隨著溫度的升高，提取液對(duì)羥自由基的清除率呈逐漸下降趨勢(shì)。所以，應(yīng)將提取溫度控制在大約40 ℃較為合適。

圖1 溶劑對(duì)羥自由基清除率的影響 圖2 溫度對(duì)羥自由基清除率的影響

2.1.3提取時(shí)間對(duì)清除率的影響 以水為提取溶劑，提取溫度為40 ℃，提取劑用量為30 mL/g的條件下分別提取1，2，3，4，5 h。結(jié)果表明：浸提時(shí)間在3 h內(nèi)，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液對(duì)羥自由基的清除率逐漸升高(圖3)；而當(dāng)提取時(shí)間超過3 h后，提取液對(duì)羥自由基的清除率隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。因此，提取時(shí)間應(yīng)控制在大約3 h。

2.1.4提取劑用量對(duì)清除率的影響 以水為提取溶劑，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為3 h的條件下，分別以提取劑用量10，20，30，40，50 mL/g進(jìn)行提取。從圖4可知，結(jié)果表明：在提取劑用量10～40 mL/g范圍內(nèi)，提取液對(duì)羥自由基的清除率隨用量增大而增大(圖4)；提取劑用量高于50 mL/g后，提取液對(duì)羥自由基的清除率有所下降。因此，提取劑用量應(yīng)控制在大約40 mL/g。

2.1.5正交試驗(yàn) 根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，清除羥自由基活性物質(zhì)提取的最佳溶劑為水，較佳提取溫度為40 ℃，較佳提取時(shí)間為3 h，較佳提取劑用量為40 mL/g，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：清除羥自由基活性物質(zhì)的最佳提取溫度為45 ℃，最佳提取時(shí)間2.5 h，最佳提取劑用量為45 mL/g(表1)。根據(jù)極差的大小，可以得到各因素對(duì)清除羥基自由基能力的影響次序由大到小依次為：提取溫度、提取時(shí)間、提取劑用量。由表2方差分析可知，提取溫度、提取劑用量和提取時(shí)間對(duì)羥自由基清除率的影響均極顯著。

圖3 提取時(shí)間對(duì)羥自由基清除率的影響 圖4 提取劑用量對(duì)羥自由基清除率的影響

表1 甘薯中清除羥自由基活性物質(zhì)提取條件的正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表2 甘薯中清除羥自由基活性物質(zhì)提取條件的正交試驗(yàn)方差分析

注：F0.05(2,16)=3.63，F(xiàn)0.01(2,16)=6.23，下同。

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，得到的優(yōu)化工藝組合為：以水為提取溶劑，提取劑用量45 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時(shí)間2.5 h，此組合不在正交試驗(yàn)中，將其編號(hào)為組合10。對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，將驗(yàn)證結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明：用組合7，組合9，組合10等3種條件進(jìn)行活性物質(zhì)的提取，羥自由基清除率最高，極顯著高于其他組合，且三者差異不顯著(表3)。綜合考慮提取效率，節(jié)省時(shí)間，清除羥自由基活性物質(zhì)的最佳提取工藝為：以水作為提取溶劑，提取劑用量45 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時(shí)間2.5 h。

2.2 清除超氧陰離子自由基活性物質(zhì)提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的確定 分別以體積分?jǐn)?shù)為0(水)，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00(無水乙醇)的乙醇作為提取溶劑，在提取溫度為40 ℃，提取劑用量30 mL/g的條件下，提取3 h。結(jié)果表明：隨著提取溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷升高，提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)以無水乙醇作為提取溶劑時(shí)，提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到最高(圖5)。所以，清除超氧陰離子自由基活性物質(zhì)的提取采用無水乙醇作提取溶劑為最佳。

表3 甘薯中清除羥自由基活性物質(zhì)提取條件的正交試驗(yàn)與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果比較

2.2.2提取溫度對(duì)超氧陰離子自由基活性物質(zhì)清除率的影響 以無水乙醇為溶劑，提取劑用量30 mL/g，分別在20，40，60，80，100 ℃條件下提取3 h。結(jié)果表明：當(dāng)提取溫度低于40 ℃時(shí)，提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨溫度升高而升高(圖6)；提取溫度為40 ℃時(shí)清除率最高；當(dāng)提取溫度高于40 ℃后，隨著提取溫度的升高，提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率呈逐漸下降趨勢(shì)。所以，應(yīng)將提取溫度控制在大約40 ℃較為合適。

圖5 溶劑對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響 圖6 溫度對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響

2.2.3提取時(shí)間對(duì)超氧陰離子自由基活性物質(zhì)清除率的影響 在無水乙醇為提取溶劑，溫度為40 ℃，提取劑用量為30 mL/g的條件下分別提取1，2，3，4，5 h。結(jié)果表明：浸提時(shí)間在3 h內(nèi)，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率逐漸升高(圖7)；而當(dāng)提取時(shí)間超過3 h后，提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。因此，提取時(shí)間應(yīng)控制在大約3 h。

2.2.4提取劑用量對(duì)超氧陰離子自由基活性物質(zhì)清除率的影響 在無水乙醇為提取溶劑，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為3 h的條件下，分別以提取劑用量10，20，30，40，50 mL/g進(jìn)行提取。結(jié)果表明：提取劑用量在10～30 mL/g范圍內(nèi)，提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨提取劑用量增大而增大(圖8)；提取劑用量高于30 mL/g后，提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率有所下降。因此，提取劑用量應(yīng)控制在大約30 mL/g。

2.2.5正交試驗(yàn) 根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，清除超氧陰離子自由基活性物質(zhì)提取的最佳提取溶劑為無水乙醇，較佳提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為3.0 h，提取劑用量為30 mL/g，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：清除超氧陰離子自由基活性物質(zhì)的最佳提取溫度為45 ℃，最佳提取時(shí)間3.0 h，最佳提取劑用量為35 mL/g(表4)。由極差的大小，可以得到各因素對(duì)超氧陰離子基自由基清除能力的影響次序由大到小依次為：提取溫度，提取劑用量，提取時(shí)間。由表5方差分析可知，提取溫度、提取劑用量和提取時(shí)間對(duì)羥自由基清除率的影響均極顯著。

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，得到的優(yōu)化工藝組合為：以無水乙醇為提取溶劑，提取劑用量35 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時(shí)間3.0 h，這與表4中的組合9一致。將正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明，用組合9進(jìn)行活性物質(zhì)的提取，所得提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率最高，顯著高于其他組合(p<0.05)。所以，清除超氧陰離子自由基活性物質(zhì)的最佳提取工藝為：以無水乙醇作為提取溶劑，提取劑用量35 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時(shí)間3.0 h。

圖7 提取時(shí)間對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響 圖8 提取劑用量對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響

表4 甘薯中清除超氧陰離子自由基活性物質(zhì)正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表5 甘薯中清除超氧陰離子自由基活性物質(zhì)正交試驗(yàn)方差分析

3 結(jié)論與討論

本次研究結(jié)果表明，甘薯中清除羥自由基活性物質(zhì)的最佳提取工藝為：以水作為提取溶劑，提取劑用量35 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時(shí)間2.5 h；甘薯中清除超氧陰離子自由基的活性物質(zhì)的最佳提取工藝為：以無水乙醇為提取溶劑，提取劑用量35 mL/g，提取溫度45 ℃，提取時(shí)間3.0 h。清除不同自由基活性物質(zhì)的最佳提取條件存在差異。

黃洪光[21]的研究結(jié)果表明，甘薯中的酚酸具有抗氧化活性；李利華等[16]的研究結(jié)果表明，甘薯多糖具有抗氧化活性。本次研究從不同的角度，即從清除不同自由基能力的角度研究甘薯活性物質(zhì)的最佳提取工藝。結(jié)果表明，甘薯中的活性物質(zhì)具有清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，前者的最佳提取溶劑是水，而后者的最佳提取溶劑是無水乙醇。這可能是因?yàn)閮深惢钚晕镔|(zhì)主要成分及性質(zhì)存在差異造成的，這也說明甘薯中不同的活性物質(zhì)對(duì)不同的自由基有不同的清除效果。所以，在利用甘薯的抗氧化活性時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同的自由基選擇不同的提取溶劑。

清除羥自由基活性物質(zhì)和清除超氧陰離子自由基活性物質(zhì)的提取率，均隨提取溫度的升高呈先升后降的趨勢(shì)，且均在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值；隨著提取溫度的進(jìn)一步升高，清除率均逐漸下降。這可能是由于隨著溫度升高，清除自由基的活性物質(zhì)會(huì)出現(xiàn)降解，從而影響清除率。但二者的下降幅度不同，超氧陰離子自由基的清除率下降的更為明顯。這也說明了兩類活性物質(zhì)主要成分及性質(zhì)的不同。關(guān)于甘薯中清除羥自由基和清除超氧陰離子自由基兩類活性物質(zhì)的主要活性成分及其含量有待于進(jìn)一步研究分析。

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