李德剛 高 敏 沙妙青 李曉蕓 楊柏燦

（上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海，201203）

從膽汁流量和膽汁酸成分改變初探“膽道不利是肥胖發(fā)病的中心環(huán)節(jié)”

李德剛 高 敏 沙妙青 李曉蕓 楊柏燦

（上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海，201203）

目的：通過對(duì)比高脂、正常大鼠膽汁流量、膽汁酸組分含量變化，初步揭示“膽道不利是肥胖發(fā)病中心環(huán)節(jié)”假說的內(nèi)在依據(jù)。方法：高脂喂養(yǎng)造成大鼠營養(yǎng)性肥胖模型；實(shí)施膽管插管手術(shù)，引流膽汁，觀測(cè)、對(duì)比膽汁流量差異；利用UPLC-MS技術(shù)觀測(cè)、對(duì)比各膽汁酸亞組分含量差異。結(jié)果：高脂組大鼠總膽汁流量及各測(cè)試點(diǎn)膽汁流量均低于正常組；高脂大鼠機(jī)體內(nèi)具有利膽、促進(jìn)脂肪代謝作用的膽汁酸含量顯著降低。結(jié)論：過量攝入高脂飲食，會(huì)加重膽代謝脂質(zhì)的負(fù)擔(dān)，造成膽道不利、膽汁不暢、膽汁酸組分改變，脂質(zhì)代謝長期失衡，久則積聚，發(fā)為肥胖。

營養(yǎng)性肥胖；膽道不利；脂質(zhì)代謝；膽汁流量；膽汁酸組分

近年來有文獻(xiàn)報(bào)道肥胖、高脂血癥等代謝性疾病與膽道疾病具有相關(guān)性［1-6］，筆者導(dǎo)師在臨床上亦發(fā)現(xiàn)高脂肥胖患者常兼具如下特征：長期飲食不節(jié)不律；多伴有高血脂、脂肪肝、糖尿病等；常兼患膽囊炎、膽結(jié)石等膽道疾病。對(duì)此，通過對(duì)膽在人體中所占地位的中醫(yī)理論的深入研究，導(dǎo)師提出：膽作為人體“中正之官”，具有“藏瀉并兼”的特性，可協(xié)調(diào)五臟六腑藏、瀉、滿、實(shí)的動(dòng)態(tài)平衡；膽汁是膽發(fā)揮功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，膽通過對(duì)膽汁的貯藏排泄，實(shí)現(xiàn)對(duì)食物的消化、吸收、排泄的調(diào)節(jié)，從而達(dá)到人體物質(zhì)能量代謝動(dòng)態(tài)平衡［7］。對(duì)膽汁的現(xiàn)代研究表明：膽汁中主要成分是膽汁酸，膽汁酸在脂類代謝中發(fā)揮著舉足輕重的作用。其能增加脂肪在小腸的吸收、增強(qiáng)脂肪酶的活性、促進(jìn)脂類乳化、在調(diào)節(jié)能量代謝中充當(dāng)信號(hào)分子等。因此，若膽道不利、膽汁不暢、膽汁酸成分改變，勢(shì)必引發(fā)脂質(zhì)代謝障礙，進(jìn)一步則發(fā)為肥胖。那么這一現(xiàn)象能否在實(shí)驗(yàn)中得以再現(xiàn)呢？為此，我們通過高脂喂服成年雄性SD大鼠制作營養(yǎng)性肥胖模型，引流膽汁，觀察正常、高脂大鼠膽汁流量及膽汁酸亞組分的差異，以判斷高脂肥胖大鼠的膽道狀況，為膽道不利、膽汁不暢是肥胖發(fā)病中心環(huán)節(jié)的假說提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠68只，體重（160±20）g左右，購自必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房中，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，適應(yīng)期結(jié)束時(shí)，大鼠體重達(dá)（200±20）g左右。

1.2 高脂飼料 飼料營養(yǎng)配比為：20%粗蛋白+40%脂肪+40%碳水化合物，由上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20101128；甲醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20110129；甲酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20110523；醋酸銨，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20090109。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠營養(yǎng)性肥胖模型制備 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，依次稱重編號(hào)，隨機(jī)抽出8只作為正常組，喂以普通飼料；其余60只為高脂組，喂以高脂飼料。兩組大鼠體重在實(shí)驗(yàn)前無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）。造模中途進(jìn)行“肥胖抵抗大鼠剔除”后（方法及結(jié)果詳見《實(shí)驗(yàn)性營養(yǎng)性肥胖模型制作的關(guān)鍵因素探析》一文），以高脂組平均體重超出正常組平均體重20%［8］為造模截點(diǎn)（以下簡(jiǎn)稱“20%標(biāo)準(zhǔn)”）。造模期間兩組大鼠自由進(jìn)食、飲水，每周稱重1次。

2.2 樣本收集

2.2.1 血清收集 采取腹主動(dòng)脈取血，血液靜置2 h，低溫離心（4℃，5 000 r/min，離心15 min），分離血清并分裝。

2.2.2 膽汁收集和流量測(cè)定 實(shí)施膽管插管手術(shù)，引流大鼠膽汁。調(diào)整大鼠至膽汁流出順暢的最佳體位，以2 mL離心管收集膽汁。從膽汁剛流出起計(jì)時(shí)10 min，之后更換全新離心管，此時(shí)開始正式收集膽汁。膽汁每30min收集1管，連續(xù)收集240min。以移液管測(cè)定每管膽汁量，記為本30 min內(nèi)膽汁流量，單位：mL/30 min。

2.3 血清中膽汁酸亞組分含量測(cè)定

2.3.1 血清前處理 將血清與甲醇按1∶3比例混勻，渦旋振蕩1 min，離心（4℃，12 000 g，離心10 min），取上清液，氮?dú)獯蹈桑?5℃），殘?jiān)?00μL的初始流動(dòng)相（0.1%甲酸+5 mmol CH3COONH4∶甲醇（45∶55）復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，離心（4℃，12 000 g，離心10 min），吸取上清液進(jìn)樣。

2.3.2 血清UPLC-MS測(cè)定條件［9］色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.0 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫45℃，流動(dòng)相A相為甲醇，B相為0.1%甲酸+5 mmol CH3COONH4。采用梯度洗脫，順序見表1。每次進(jìn)樣2μL，流速0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：選用負(fù)離子模式下電噴霧電離，離子檢測(cè)模式定量的方法，離子源溫度為120℃，去溶劑化溫度為300℃，去溶劑化氣流流速700 L/h，毛細(xì)管電壓為3 kV，錐孔電壓55 V，錐孔氣流流速50 L/h。

表1 液相洗脫順序

2.4 膽汁中膽汁酸亞組分含量測(cè)定

2.4.1 膽汁前處理 將膽汁與甲醇按1∶200比例混勻，超聲3min，離心（15℃，1 600 g，離心10 min），收集上清，殘?jiān)尤胍掖迹瑴u旋1 min，離心。收集上清液，合并兩次上清液并揮干，加入1 mL甲醇，渦旋1 min，吸取10μL進(jìn)樣。

2.4.2 膽汁UPLC-MS測(cè)定條件 同“2.3.2”。

2.5 測(cè)定指標(biāo)

2.5.1 營養(yǎng)性肥胖模型 大鼠行為學(xué)觀察：觀察兩組大鼠日常大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)、糞便等狀況。體重：以周為單位記錄大鼠體重，單位：g。

2.5.2 膽汁流量 膽汁分流量：用移液器測(cè)定大鼠每30 min膽汁流量，單位：mL/30min。膽汁總流量：測(cè)定大鼠240 min內(nèi)膽汁總流量。單位：mL。

2.5.3 膽汁酸亞組分含量 應(yīng)用UPLC-MS測(cè)定血清和膽汁中各膽汁酸亞組分含量，單位：ng/m L。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法 不同的資料采用不同的統(tǒng)計(jì)方法。當(dāng)資料滿足正態(tài)分布且方差齊性時(shí)，采用兩樣本t檢驗(yàn)；當(dāng)資料不滿足正態(tài)分布或/和方差不齊時(shí)，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；膽汁酸含量數(shù)據(jù)用MassLynx 4.1軟件采集和輸出。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 營養(yǎng)性肥胖造模

3.1.1 兩次初始體重驗(yàn)證 兩次初始體重驗(yàn)證結(jié)果分別為：P＝0.890＞0.05；P＝0.086＞0.05。兩次驗(yàn)證均有力佐證正常組、高脂組大鼠初始體重的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組大鼠后期體重差異均由高脂喂養(yǎng)所致。詳見表2。

表2 兩次初始體重驗(yàn)證（g）

3.1.2 日常行為學(xué)觀察 造模期間，高脂組大鼠毛發(fā)偏油亮，部分甚至出現(xiàn)毛發(fā)變黃；籠內(nèi)糞便多，氣味濃重，須頻繁更換墊料；多團(tuán)縮于角落，行動(dòng)遲緩，精神萎靡；抓取之并無劇烈反抗，但甩尾力量大。正常組大鼠精神狀態(tài)良好，行動(dòng)靈活，毛發(fā)、糞便均未出現(xiàn)異樣，抓取時(shí)常伴有強(qiáng)烈掙扎。

3.1.3 體重比較 肥胖抵抗鼠剔除后，以“20%標(biāo)準(zhǔn)”為造模截點(diǎn)，結(jié)果顯示：造模共歷時(shí)9周，高脂組大鼠平均體重超出正常組大鼠平均體重21.09%，在高脂喂養(yǎng)第2周時(shí)，兩組大鼠平均體重即已出現(xiàn)顯著性差異。表明：高脂組大鼠體重已達(dá)到營養(yǎng)性肥胖標(biāo)準(zhǔn)。詳見表3、圖1、圖2。

表3 正常組、高脂組大鼠體重變化（±s）

表3 正常組、高脂組大鼠體重變化（±s）

注：正常組與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

周數(shù)（week）正常組（g）高脂組（g）0 206.13±4.70 208.10±7.25 1 255.75±11.03 272.67±12.84*2 297.75±15.85 331.57±18.41 3 327.75±17.84 375.67±19.47 4 355.25±33.55 415.27±22.34 5 400.00±20.29 448.30±25.45 6 421.88±21.50 478.87±26.81 7 438.13±21.55 510.37±31.35 8 451.50±20.63 528.17±34.89 454.13±37.46 549.90±31.57 9

圖1 正常組、高脂組大鼠體重變化曲線圖

圖2 正常組、高脂組大鼠體型對(duì)比

3.2 膽汁流量比較 觀察兩組大鼠膽汁流量，發(fā)現(xiàn)以下特征：1）在膽汁流量趨勢(shì)變化上，兩組大鼠膽汁流量均隨時(shí)間延長呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)；2）在各時(shí)間點(diǎn)膽汁流量上，正常組在每個(gè)測(cè)試點(diǎn)的平均膽汁流量均高于高脂組；3）在總膽汁流量上，在收集的240 min內(nèi)，正常組總膽汁流量高于高脂組。以上結(jié)果提示：相較正常個(gè)體，肥胖個(gè)體會(huì)呈現(xiàn)膽汁分泌減少、膽汁分泌不暢的特征。詳見表4、圖3。

表4 正常組、高脂組大鼠膽汁流量比較

圖3 正常組、高脂組大鼠膽汁流量比較

表5 正常組、高脂組大鼠血清中各膽汁酸亞組分含量比較

3.3 膽汁酸亞組分含量比較

3.3.1 血清中膽汁酸亞組分含量比較 血清中各膽汁酸亞組分檢測(cè)結(jié)果顯示：在檢測(cè)到的10種膽汁酸組分中（牛磺熊去氧膽酸、?；秦i去氧膽酸、牛磺膽酸、甘氨膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸、牛磺去氧膽酸、豬去氧膽酸、膽酸、去氧膽酸），除?；切苋パ跄懰?、豬去氧膽酸外，高脂組較正常組各膽汁酸亞組分含量均呈現(xiàn)不同程度下降。其中?；秦i去氧膽酸、牛磺膽酸、熊去氧膽酸3種膽汁酸含量在兩組間存在的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高脂組甘氨膽酸、牛磺鵝去氧膽酸、牛磺去氧膽酸、去氧膽酸含量較正常組僅有一定程度下降，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示：肥胖發(fā)病時(shí)，機(jī)體血清中某些膽汁酸含量會(huì)呈現(xiàn)下降甚至顯著下降特征。詳見表5、圖4。

圖4 正常組、高脂組大鼠各膽汁酸組分比較

表6 正常組、高脂組大鼠膽汁中各膽汁酸組分含量比較

3.3.2 膽汁中膽汁酸亞組分含量比較 膽汁中各膽汁酸亞組分檢測(cè)結(jié)果顯示：在檢測(cè)到的6種膽汁酸組分中（?；切苋パ跄懰帷⑴；秦i去氧膽酸、?；悄懰?、甘氨膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸），高脂組較正常組各膽汁酸含量均呈現(xiàn)不同程度下降。其中?；切苋パ跄懰?、甘氨膽酸含量在兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），?；秦i去氧膽酸、熊去氧膽酸、?；悄懰岷吭趦山M間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高脂組?；蛆Z去氧膽酸含量較正常組僅有一定程度下降，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示：肥胖發(fā)病時(shí)，機(jī)體膽汁中某些膽汁酸含量會(huì)呈現(xiàn)下降甚至顯著下降特征。詳見表6、圖5。

4 討論

中醫(yī)稱膽為中精之府，結(jié)構(gòu)似腑，功能似臟，藏瀉并兼，其貯藏膽汁有“精汁”之美譽(yù)。膽汁乃肝之余氣溢入于膽所化生，膽疏泄膽汁于腸胃參與水谷運(yùn)化，以通為順，現(xiàn)代研究亦表明：膽汁酸是存在于膽汁中一類膽烷酸的總稱，是膽汁中除水以外的最主要成分。膽汁酸與脂質(zhì)代謝具有十分密切的關(guān)系。膽汁酸途徑是膽固醇體內(nèi)代謝的主要途徑，人體每日近半數(shù)的膽固醇被分解成為膽汁酸后經(jīng)肝臟排出體外。膽汁酸在機(jī)體內(nèi)主要以膽汁酸鹽的形式存在，脂肪的消化主要發(fā)生在小腸，必須經(jīng)過膽汁酸鹽及各種酶的作用，方能水解為脂肪酸和甘油。綜上不難看出：膽汁疏泄通暢，則肝氣調(diào)達(dá)，全身氣機(jī)條暢?？杀Ｒ簧碇镔|(zhì)能量代謝平衡。但凡能影響膽疏泄通降的因素都能引起膽道功能不調(diào)，膽汁不暢，從而直接妨礙正常脂質(zhì)代謝。

本研究證實(shí)：肥胖大鼠在膽汁總流量、膽汁分流量以及部分膽汁酸亞組分含量上均呈現(xiàn)不同程度下降，在含量下降顯著的膽汁酸亞組分中，牛磺熊去氧膽酸是在肝臟內(nèi)形成的結(jié)合型次級(jí)膽汁酸，具有抗炎、利膽、溶石作用［10］；甘氨膽酸是在肝臟內(nèi)形成的結(jié)合型初級(jí)膽汁酸，有助于脂肪消化吸收［11］；熊去氧膽酸是在腸道內(nèi)生成的次級(jí)膽汁酸，其膽酸鹽具有顯著的利膽作用，能增強(qiáng)膽汁酸的分泌，降低膽汁中膽固醇及膽固醇酯的含量［12］；?；悄懰崾窃诟闻K內(nèi)生成的結(jié)合型初級(jí)膽汁酸，能刺激肝細(xì)胞分泌膽汁，并促進(jìn)脂肪的乳化和吸收，有利于脂溶性維生素吸收［13］；膽酸是在肝臟內(nèi)生成的初級(jí)膽汁酸，在膽汁中以甘膽膽酸或?；悄懰岬男问酱嬖冢纱龠M(jìn)脂類的消化和吸收［14］；?；秦i去氧膽酸具有抗炎和促進(jìn)組織修復(fù)作用，并能調(diào)節(jié)免疫，對(duì)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎具有一定的治療作用［15］。從中不難發(fā)現(xiàn)：肥胖發(fā)病時(shí)，機(jī)體內(nèi)具有促進(jìn)膽汁分泌、促進(jìn)脂肪消化吸收作用的膽汁酸含量會(huì)顯著降低。

綜上所述初步推測(cè)：過食高脂厚味會(huì)加重膽調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的負(fù)擔(dān)，致使膽道功能紊亂，突出表現(xiàn)為膽汁分泌量減少，膽汁分泌不暢，并進(jìn)一步可造成機(jī)體內(nèi)中具有利膽、促進(jìn)脂肪代謝作用的膽汁酸組分含量減少，長此以往，體內(nèi)脂類長期代謝失衡，日久積聚，發(fā)為肥胖。此乃膽道不利為肥胖發(fā)病之中心環(huán)節(jié)的內(nèi)在依據(jù)。本研究從實(shí)驗(yàn)角度初步揭示了膽道不利與肥胖發(fā)病的關(guān)聯(lián)，隨著后續(xù)對(duì)膽汁酸特性及作用機(jī)制的進(jìn)一步探索，必將為肥胖的防治提供新的思路和方法。

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（2013-05-26收稿 責(zé)任編輯：徐暉）

Preliminary Exploration on＂Biliary Tract Adverseness is the Central Link of Obesity＂by Changing Bile Flow and Bile Acid Components

Li Degang，Gao Min，Sha Miaoqing，Li Xiaoyun，Yang Baican
（Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

Objective：By comparing the difference of bile flow and bile acid components between high-fat and normal rats，we tried to reveal the basis of hypothesis which biliary tract adverseness is the central link of obesity.Methods：Building nutritional obesity rat model by high fat diet.Bile duct intubation operation was implemented to collect bile and then compare the bile flow difference.UPLC-MS was used to compare the content of different kinds of bile acid components.Results：Both total and individual test point bile flow of obese rats were lower than those of normal rats.The content of bile acids that had cholagogic effect and promoting fat metabolism in highfat diet rats reduced significantly.Conclusion：Intaking excessive high-fat diet can increase the burden of bile，resulting in biliary tract adverseness，an unsmooth flow and changes of bile acid components.Long-term imbalance of lipid metabolism will finally leads to obesity.

Nutritional obesity；Biliary tract adverseness；Lipid metabolism；Bile flow；Bile acid components

Q548+.5；R723.14

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.03.030

楊柏燦，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥復(fù)方藥效評(píng)價(jià)、中藥學(xué)教學(xué)和中醫(yī)臨床研究工作，Tel：021-51322208，E-mail：bcy2002＠sina.com