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        染料木素對非小細(xì)胞型肺癌A549/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響①

        2014-02-05 13:58:20陸紅玲宋永祥李大玉遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科遵義563099
        中國免疫學(xué)雜志 2014年5期
        關(guān)鍵詞:木素抑制率染料

        任 彥 陸紅玲 宋永祥 李大玉 徐 剛 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科,遵義563099)

        染料木素對非小細(xì)胞型肺癌A549/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響①

        任 彥 陸紅玲②宋永祥 李大玉②徐 剛 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科,遵義563099)

        目的:觀察染料木素(genistein)對人非小細(xì)胞型肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)A549/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法:培養(yǎng)A549及A549/DDP細(xì)胞株,以A549細(xì)胞為對照。①M(fèi)TT法測定A549及A549/DDP細(xì)胞對順鉑的 IC50值、耐藥倍數(shù)及細(xì)胞增殖抑制率;②測定0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、60、80 μg/ml染料木素作用48 h 對 A549/DDP 細(xì)胞增殖的抑制率及IC50值;③用6.25、12.5、25 μg/ml染料木素處理A549/DDP細(xì)胞24 h后,經(jīng)流式細(xì)胞計量儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:①A549及A549/DDP細(xì)胞對順鉑的IC50值分別為33.6 μmol/L和76.9 μmol/L,耐藥倍數(shù)為2.3;細(xì)胞增殖抑制率隨順鉑濃度增加而逐漸加大;②染料木素對A549/DDP細(xì)胞生長的影響,隨染料木素濃度增加表現(xiàn)為先促增殖后抑制的作用,其對 A549 及 A549/DDP 細(xì)胞的 IC50值分別為 85.1 μg/ml和 80.2 μg/ml;③6.25、12.5、25 μg/ml染料木素作用于A549/DDP細(xì)胞24 h后,隨染料木素濃度的增加,停留于G2/M期的細(xì)胞數(shù)逐漸增多(P<0.05),同時A549/DDP細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。結(jié)論:染料木素可抑制A549/DDP細(xì)胞的生長,將細(xì)胞阻滯于G2/M期,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

        染料木素;人非小細(xì)胞型肺癌A549/DDP細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

        肺癌是對人類健康和生命威脅最嚴(yán)重的腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率居各類惡性腫瘤的前列[1]。據(jù)報道,惡性腫瘤局部治療(手術(shù)或放療)前給予的化療,可明顯提高病人的生存率[2]。順鉑(Cisplatine,DDP)是非小細(xì)胞型肺癌(NSCLC)化療方案中的一線藥物,但其療效一直不盡人意,主要原因是肺癌耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生[3]。染料木素(Genistein)屬于異黃酮類化合物,具有多種生物學(xué)活性[4]。大量體外實(shí)驗(yàn)表明[5-10],染料木素可抑制胃癌、宮頸癌、前列腺癌等癌細(xì)胞生長和刺激分化,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,具有一定的抗腫瘤作用。但關(guān)于染料木素對耐順鉑的人非小細(xì)胞肺癌A549/DDP細(xì)胞生長的影響少有報道。本實(shí)驗(yàn)采用A549/DDP細(xì)胞株為研究對象,觀察染料木素對A549/DDP細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料 非小細(xì)胞型肺癌A549及A549/ DDP細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院),RP-

        MI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司),MTT試劑(Amresco公司),順鉑(DDP,TCI東京化成工業(yè)株式會社),染料木素(美國 Sigma公司,純度≥98%),其余為國產(chǎn)試劑。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549/DDP細(xì)胞和 A549細(xì)胞分別接種于含10%胎牛血清及1%雙抗的完全培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2~3 d傳代1次。

        1.2.2 MTT法檢測 A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性:取對數(shù)生長期的A549和A549/DDP細(xì)胞,制成2.5 ×104ml-1的細(xì)胞懸液,按每孔 90 μl分別接種于96孔板中(空白對照組加入等體積不含細(xì)胞的培養(yǎng)液),于細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁生長24 h,分別加入不同濃度的DDP工作液10 μl(DDP液的濃度依次為:0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80、160 μmol/L),每個濃度設(shè)6個復(fù)孔,再培養(yǎng)48 h后,每孔加入5 mg/ml的 MTT 溶液 10 μl,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,棄去 96 孔培養(yǎng)板中的液體,每孔加入200 μl DMSO,置搖床避光輕輕振搖10 min,在全自動酶標(biāo)儀波長為565 nm處測定吸光度值(OD值)。根據(jù)OD值計算出細(xì)胞生長抑制率、細(xì)胞半數(shù)抑制率(IC50)及耐藥倍數(shù)。

        1.2.3 MTT法測定染料木素對A549和A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制率 A549及A549/DDP細(xì)胞處理同前。在96孔板中分別加入10 μl不同濃度的染料木素工作液(0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、60、80 μg/ml)作用48 h。按上述方法,測定染料木素對細(xì)胞的IC50值及細(xì)胞增殖抑制率。

        1.2.4 流式細(xì)胞計量儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期將A549/DDP細(xì)胞(1×105細(xì)胞/ml)接種于6孔培養(yǎng)板中,分別用不同濃度的染料木素(0、6.25、12.5、25 μg/ml)處理24 h 后,消化收集細(xì)胞。加入預(yù)冷無水乙醇慢搖5次,放入4℃保存。18 h后取出細(xì)胞加入RNase,置37℃孵箱反應(yīng)30 min后取出,加入濃度為1 mg/ml的碘化丙啶(PI),避光反應(yīng)30 min后,用流式細(xì)胞計量儀檢測細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的分布情況。

        2 結(jié)果

        2.1 MTT檢測結(jié)果 ①用不同濃度 DDP作用A549/DDP和 A549細(xì)胞48 h后,與A549細(xì)胞相比,A549/DDP細(xì)胞對DDP作用不敏感,當(dāng)DDP濃度>20 μmol/L后,細(xì)胞生長才出現(xiàn)明顯抑制(見圖1)。所計算出兩種細(xì)胞IC50值分別為76.9和33.6 μM,耐藥倍數(shù)為2.3。②不同濃度染料木素作用A549/DDP和A549細(xì)胞48 h后,MTT結(jié)果顯示,隨藥物濃度增加,兩種細(xì)胞生長均呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的作用,以A549細(xì)胞生長變化較大(見圖2)。兩種細(xì)胞的 IC50值分別為 85.1 和 80.2 μg/ml,二者比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

        圖1 不同濃度DDP作用A549和A549/DDP細(xì)胞48 h后細(xì)胞生長的抑制率Fig.1 Inhibition ratio of A549/DDP after 48 hours treatment with different concentration of DDP

        圖2 不同濃度染料木素作用A549和A549/DDP細(xì)胞48 h后細(xì)胞生長的抑制率Fig.2 Inhibition ratio of A549/DDP after 48 hours treatment with different concentration of genistein

        表1 染料木素作用A549及A549/DDP細(xì)胞24 h的細(xì)胞凋亡情況(%)Tab.1 Apoptotic rate of A549 and A549/DDP after 24 hours treatment with genistein

        圖3 不同濃度染料木素作用于A549及A549/DDP細(xì)胞24 h的DNA組方圖Fig.3 DNA content figure of A549 and A549/DDP cells after 24 hours treatment with genistein

        表2 染料木素作用于A549及A549/DDP細(xì)胞24 h各細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)Tab.2 Cell counts of A549 and A549/DDP in cell cycle after 24 hours treatment with genistein

        圖4 不同濃度染料木素作用A549及A549/DDP的細(xì)胞周期分析圖Fig.4 Cell cycle analysis figure of A549 and A549/DDP after 24 hours treatment with different concentration genistein

        2.2 流式細(xì)胞計量儀檢測染料木素對 A549和A549/DDP細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 染料木素作用A549和A549/DDP細(xì)胞24 h后,隨染料木素濃度增加,細(xì)胞凋亡比例有增加趨勢(表1),組方圖提示細(xì)胞DNA含量減少,并出現(xiàn)凋亡特有的標(biāo)志,即“G1亞峰”,見圖3。細(xì)胞周期檢測結(jié)果提示,隨染料木素濃度增加,停滯于G2/M期的細(xì)胞數(shù)逐漸增多,見表2、圖4。

        3 討論

        盡管目前對癌癥的治療手段和方法越來越多,但大部分惡性腫瘤的治療仍不理想,肺癌也是如此。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,肺癌術(shù)后5年生存率為15%,而在我國甚至低于10%[2]。因此,綜合治療仍然是NSCLC治療的主要方法。順鉑具有廣泛的抗瘤譜,是NSCLC化療方案中的一線藥物。然而,腫瘤細(xì)胞固有的以及獲得性的耐藥問題,嚴(yán)重阻礙了藥物的作用,影響化療的預(yù)后[11]。染料木素屬于具有弱雌激素樣作用的異黃酮類化合物,存在于人及動物食用的各種植物中,具有多種生物學(xué)活性,是大豆有效抑癌成分之一[4]。大量研究已經(jīng)證明,染料木素具有廣泛的抗惡性細(xì)胞增殖作用,能誘導(dǎo)惡性細(xì)胞的分化,抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和侵襲以及腫瘤的轉(zhuǎn)移[12-15]。

        本實(shí)驗(yàn)采用的是耐順鉑的人非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞株A549/DDP,與 A549細(xì)胞相比,A549/DDP對順鉑的耐藥倍數(shù)為2.3,可應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),染料木素作用A549及A549/ DDP 細(xì)胞時,IC50值分別為 85.1 μg/ml和 80.2 μg/ ml,二者比較無統(tǒng)計學(xué)差異,表明染料木素對兩種細(xì)胞株的作用一致。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果觀察到,隨著染料木素濃度的逐漸增加,細(xì)胞周期開始出現(xiàn)改變,結(jié)果顯示25 μg/ml的染料木素作用于細(xì)胞24 h后,DNA含量比未用藥時明顯減少(圖3),停滯于G2/M期的細(xì)胞數(shù)增多,細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡,推測染料木素可以使A549/DDP細(xì)胞于G2/M調(diào)控點(diǎn)阻滯。此外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),當(dāng)染料木素濃度為0~20 μg/ml時,對A549及A549/DDP細(xì)胞均有促進(jìn)增殖作用(對A549細(xì)胞作用更明顯),而當(dāng)染料木素濃度大于20 μg/ml時,兩株細(xì)胞開始呈現(xiàn)劑量依賴性生長抑制現(xiàn)象(見圖2)。有文獻(xiàn)報道染料木素可能是雌激素受體的調(diào)節(jié)劑,通過與雌激素受體(ER)結(jié)合,表現(xiàn)出雌激素活性和抗雌激素活性[16],這兩種重要的生物學(xué)活性對于癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展起著關(guān)鍵作用。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測,由于染料木素結(jié)構(gòu)與雌二醇具有一定的相似性,染料木素可能先發(fā)揮其弱雌激素樣活性,促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖;隨著染料木素濃度的逐漸增高,繼而發(fā)揮其抗雌激素活性,從而起到抑制癌細(xì)胞生長的作用。但上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象尚有待進(jìn)一步研究。

        本文借此向中科院生物物理研究所衛(wèi)濤濤研究員、姜鵬濤博士對本實(shí)驗(yàn)研究提供的幫助表示衷心的感謝。

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        [收稿2013-11-25 修回2013-12-12]

        (編輯 許四平)

        Effects of genistein on proliferation and apoptosis of human non-small cell lung cancer cell line A549/DDP

        REN Yan,LU Hong-Ling,SONG Yong-Xiang,LI Da-Yu,XU Gang.Department of Thoracic Cardiac Surgery,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563099,China

        Objective:To observe the effects of genistein on proliferation and apoptosis of human non-small cell lung cancer cell line A549/DDP.Methods①M(fèi)TT assay was applied to evaluate the resistance index of A549/DDP cell line to cisplatin and half inhibitory concentration(IC50).②Inhibition rate of A549/DDP cell proliferation and IC50value were evaluated by MTT assay after treatment with 0,1.25,2.5,5.0,10,20,40,60,80 μg/ml genistein for 48 hour respectively.③A549/DDP cell cycle and apoptosis were evaluated by flow cytometry after treatment with 6.25,12.5,25 μg/ml genistein for 24 hours respectively.Results①In exposing to cisplatin,the IC50of A549 and A549/DDP was 33.6 μmol/L and 76.9 μmol/L respectively.The resistance index was 2.3.Cell growth inhibition rate increased following the cisplatin concentration increasing gradually.②A549/DDP growth inhibition rate increased at first and later decreased gradually following treatment with the genistein dose increased.The IC50of A549 and A549/DDP was about 85.1 μg/ml and 80.2 μg/ml respectively.③After treatment with 6.25,12.5,25 μg/ml genistein for 24 hours,there were more A549/DDP cells arresting and showing apoptosis along with the genistein dose increased.ConclusionGenistein can inhibit A549/DDP proliferation,cause A549/DDP arresting in G2/M phase and induce A549/DDP cell apoptosis with dose dependently.

        Genistein;Human non-small cell lung cancer cell line A549/DDP;Proliferation;Apoptosis

        R735.1

        A

        1000-484X(2014)05-0669-04

        10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.022

        ①本文受貴州省科學(xué)技術(shù)基金(No.黔科合J字LKZ[2010]20)資助。

        ②遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,遵義563099。

        任 彥(1988年-),女,住院醫(yī)師,主要從事肺癌的發(fā)病機(jī)理及防治的研究。

        及指導(dǎo)教師:徐 剛(1966年-),男,主任醫(yī)師,主要從事肺癌的發(fā)病機(jī)理及防治的研究。

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