付靜靜 盛康亮 李 影 李培培 汪慶童 陳鏡宇 吳華勛 張玲玲 魏 偉(安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，合肥230032)

小鼠骨髓源耐受性樹突細胞的分離培養(yǎng)及功能鑒定①

付靜靜 盛康亮②李 影 李培培 汪慶童 陳鏡宇 吳華勛 張玲玲 魏 偉(安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，合肥230032)

目的:建立小鼠骨髓源耐受性樹突狀細胞(CD11b+F4/80+TDCs)體外培養(yǎng)及功能鑒定方法。方法:以重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組白介素4(rmIL-4)體外誘導小鼠骨髓細胞分化為未成熟樹突細胞(iDCs)，收集第六天的細胞采用流式細胞術分離純化CD11b+F4/80+TDCs。倒置顯微鏡動態(tài)觀察細胞形態(tài)學變化，流式細胞術觀察并分選CD11b+F4/80+TDCs，CD11b+F4/80+TDCs的耐受功能通過MHCⅡ類分子、CD83、IDO、TLR-2的表達及IL-10和TGF-β1細胞因子的產(chǎn)生進行評價。流式細胞術測定MHCⅡ類分子表達，免疫組化法測定CD83、IDO、TLR-2的表達，ELISA法測定IL-10和TGF-β1的水平，同時設LPS刺激誘導的成熟樹突細胞(mDCs)作對照。結果:鏡下可見新鮮分離的骨髓細胞呈圓形，體積小，2 d后，部分細胞形態(tài)發(fā)生改變，體積增大，細胞聚集成團，培養(yǎng)5～6 d，細胞集落增多，形態(tài)不規(guī)則。同時表面出現(xiàn)較多毛刺樣突起。CD11b+F4/80+TDCs含量在23%左右，經(jīng)流式分選后細胞純度達到99%以上。與mDCs比較，CD11b+F4/80+TDCs低表達MHCⅡ和CD83，高表達IDO、TLR-2，并分泌IL-10和TGF-β1。結論:用小鼠rmGM-CSF和rmIL-4體外能成功誘導小鼠骨髓源CD11b+F4/80+TDCs，并且CD11b+F4/80+TDCs通過表達IL-10、TGF-β1、IDO和TLR-2顯示耐受功能。

耐受性樹突細胞;骨髓源;分離;功能鑒定

樹突細胞(Dendritic cells，DCs)作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的專職抗原遞呈細胞(Antigen-presenting cell，APC)，在參與T細胞免疫和維持外周免疫耐受中起重要作用[1，2]。DCs具有免疫原性和耐受性雙重作用，DCs的免疫原性表現(xiàn)為能夠激活初始T淋巴細胞，在T淋巴細胞依賴的體液免疫和細胞免疫反應中處于啟動、調控以及維持免疫應答的中心環(huán)節(jié);DCs的耐受性表現(xiàn)為能夠誘導抗原特異性T細胞的凋亡、無能和調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)的產(chǎn)生，引起免疫耐受[3，4]。DCs這種獨特功能與其不同的激活和分化狀態(tài)有關:未成熟DCs(immature DC，iDCs)或耐受性DCs(Tolerogenic dendritic cells，TDCs)通過表面受體介導的吞噬、飽飲、內吞作用而攝取、加工和處理抗原，誘導免疫耐受;iDCs在遷移到次級淋巴結過程中逐漸成熟，成熟DCs(mature dendritic cells，mDCs)通過高表達MHCⅡ和共刺激分子提呈抗原并活化T細胞，參與細胞免疫和T細胞依賴的體液免疫反應，表現(xiàn)為免疫原性，誘導免疫應答的產(chǎn)生[5]。

TDCs誘導免疫耐受機制主要通過分泌IL-10及TGF-β1、表達抑制性免疫球蛋白樣轉錄因子-3 (Inhibitory immunoglobulin-like transcript，ILT-3)及程序死亡配體(Programmed cell death legend-1，PDL1)等[6-8];TDCs 分泌吲哚胺 2，3-雙加氧酶(Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)，IDO 抑制 T細胞反應、促進效應性T細胞的凋亡、并通過激活 GCN2激酶途徑阻滯Treg向Th17的分化，促進免疫耐受形成[4，9];TDCs 高表達 Toll樣受體-2(Toll-like receptor，TLR-2)，促進 Th0 細胞向 Th2 的分化[10，11]。

TDCs在體內含量非常低，直接從體內分離TDCs操作復雜，且難以分離純化，限制了TDCs進一步研究與應用。盡管有關DCs的體外分離方法多有報道，但CD11b+F4/80+TDCs的分離和耐受功能的鑒定方法尚無報道。本實驗采用體外細胞因子聯(lián)合培養(yǎng)的方法，誘導小鼠骨髓細胞分化為iDCs，并采用流式細胞術分離純化CD11b+F4/80+TDCs。對純化后的CD11b+F4/80+TDCs進行形態(tài)學和耐受功能鑒定，為進一步將CD11b+F4/80+TDCs用于炎癥免疫性疾病的細胞免疫治療研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康C57BL/6小鼠，雄性，體質量(20±2)g，7～8周齡，購自安徽醫(yī)科大學動物實驗中心，標準化清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，合格證號: SCXK(皖)2005-001號。

1.2 主要試劑 重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(recombinant mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF)和重組小鼠白介素4(recombinant mouse interleukin-4，rmIL-4)購自Peprotech公司;脂多糖(LPS)購自美國 Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司;胎牛血清(Fetal calf serum，F(xiàn)CS)購自Hyclone公司;FITC標記 Anti-mouse-CD11b，PE標記 Anti-mouse-F4/80和APC標記Anti-mouse-MHCⅡ等熒光抗體及同型對照抗體均購于BioLegend公司;兔抗小鼠 IDO(bs-2379R)和兔抗小鼠TLR-2(sc-10739)一抗均購自北京Bioss公司，兔抗小鼠CD83(Bs2204)一抗購自Bioworld公司，辣根過氧化酶羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋公司;小鼠IL-10和TGF-β1 ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 方法

1.3.1 體外制備骨髓源DCs 脫臼處死小鼠，無菌分離小鼠后肢股骨和脛骨，750 ml/L酒精浸泡5 min，PBS洗2次;剪刀剪去骨兩端，用5 ml注射器抽取RPMI1640液，分別從骨兩端插入骨髓腔，反復沖洗出骨髓直至骨髓腔變白;200目紗網(wǎng)過濾骨髓懸液，2 000 r/min離心10 min后，棄上清液，以完全培養(yǎng)液(含 RPMI1640，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1× 105U/L青霉素，100 g/L鏈霉素，50 mmol/L 2-巰基乙醇和100 ml/L胎牛血清)重懸細胞，濃度調整為5×109個細胞/L;接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml，置37℃，5 ml/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，去除非黏附粒細胞，更換新鮮培養(yǎng)基，并加入 rmGM-CSF (20 μg/L)和 rmIL-4(20 μg/L);每日用相差顯微鏡觀察細胞的生長和形態(tài)變化，隔天半量換液，培養(yǎng)6 d收集懸浮細胞，并輕輕吹打6孔板孔壁，所得一并收集，獲得 iDCs。對照組于第 6天加入 LPS (1 mg/L)孵育 24 h，獲得 mDCs[5，12]。

1.3.2 流式細胞術分析CD11b+F4/80+TDCs百分含量及MHCⅡ類分子表達 收集培養(yǎng)的DCs，調細胞濃度為1×109個細胞/L，分裝于流式管中。加入1 μl的FITC標記的抗小鼠CD11b和PE標記的抗小鼠F4/80、APC標記的抗小鼠MHCⅡ類分子單克隆抗體，同時設PE、FITC或APC標記的正常小鼠

IgG抗體做陰性對照，4℃孵育30 min，流式細胞儀檢測CD11b+F4/80+TDCs的百分含量和MHCⅡ類分子表達，并分離純化CD11b+F4/80+TDCs。流式細胞分選儀分選后的CD11b+F4/80+TDCs用于后續(xù)實驗。

1.3.3 免疫組化法檢測CD83、IDO和TLR-2的表達(采用SP法) 將CD11b+F4/80+TDCs滴入載玻片上至半干，用40 ml/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次;30 ml/L H2O2去離子水室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性;在細胞玻片上加50 ml/L羊血清封閉非特異性蛋白室溫孵育20 min;加稀釋好的一抗4℃過夜，CD83、IDO和TLR-2稀釋比例為1∶200。其余步驟按說明書進行。同時設LPS誘導的mDCs作為對照。

1.3.4 ELISA 法測定 DCs上清 IL-10 和 TGF-β1 水平 第7天收集誘導的DCs細胞上清，1 500 r/min離心5 min，上清收集后-20℃保存。細胞培養(yǎng)上清IL-10和 TGF-β1水平檢測采用 ELISA法，同時設LPS誘導的mDCs作為對照。步驟按說明書進行。1.4 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)以x-±s表示。數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用方差分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨髓源DCs的形態(tài)觀察 新鮮分離的小鼠骨髓細胞呈圓形，體積小，培養(yǎng)4 h后開始貼壁;2 d后，在細胞因子的刺激下，細胞體積逐漸變大，并且增殖旺盛，細胞貼壁生長，單個散在的細胞呈現(xiàn)較小的集落，簇狀生長，少部分細胞形態(tài)由圓形變?yōu)槁褕A形;培養(yǎng)3～4 d，10～20個細胞聚集成團，可見有少量散在的半懸浮細胞，高倍鏡下可見細胞邊緣呈毛刺樣突起;培養(yǎng)5～6 d，集落體積變小，5～10個細胞聚集成團，但半懸浮生長的集落數(shù)量增多，細胞呈卵圓形，少數(shù)細胞形態(tài)不規(guī)則，同時高倍鏡下可見細胞表面出現(xiàn)較多毛刺樣突起，此時為典型的iDCs(圖1)。

圖1 骨髓源DCs的形態(tài)學變化(×200)Fig.1 Morphology of bone marrow DCs in different time

2.2 流式細胞術分析CD11b+F4/80+TDCs百分含量 收集培養(yǎng)第6天的細胞，應用熒光抗體雙標記染色和流式細胞儀對兩組小鼠髓源性TDCs表面標志物 CD11b+F4/80+進行檢測，檢測結果顯示rmGM-CSF和 rmIL-4誘導的 CD11b+F4/80+TDCs，含量為20%左右(圖2)。并采用流式細胞分選系統(tǒng)分離純化CD11b+F4/80+TDCs，純化后細胞純度達99%左右(圖2)。并將純化后的CD11b+F4/80+TDCs用于后續(xù)實驗。

2.3 CD11b+F4/80+TDCs低表達CD83和 MHCⅡ類分子 CD83是mDCs的特異性標志，TDCs幾乎不表達CD83。本實驗收集純化后的骨髓源TDCs，采用免疫組化SP法檢測CD83在TDCs中的表達，CD83陽性產(chǎn)物呈棕褐色，結果顯示:rmGM-CSF和rmIL-4誘導的 CD11b+F4/80+TDCs，CD83表達缺乏，而經(jīng)LPS誘導的DCs有大量CD83表達，且表達在DCs細胞胞膜上(圖3)。

MHCⅡ類分子是一個抗原呈遞表面分子，主要表達在免疫原性和活化的mDCs上。本實驗采用流式細胞術檢測兩組DCs中MHCⅡ類分子表達，結果顯示，與mDCs相比，TDCs表達MHCⅡ類分子明顯較低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示rmGMCSF和rmIL-4誘導的DCs呈現(xiàn)非成熟表型，而LPS誘導的DCs顯示成熟特性(圖4)。

圖2 流式細胞術分析并純化CD11b+F4/80+TDCsFig.2 Evaluation and purify of CD11b+F4/80+TDCs by fluorescence-activated cell sorting system

2.4 CD11b+F4/80+TDCs高表達耐受性標志IDO和TLR-2 本實驗收集純化后的骨髓源TDCs，用免疫組化SP法分別檢測IDO和TLR-2在TDCs中的表達。結果顯示:rmGM-CSF和rmIL-4誘導的TDCs高表達 IDO，且IDO表達在TDCs細胞胞漿中，而LPS誘導的DCs表達IDO較少(圖5);TDCs同樣也高表達TLR-2，且TLR-2表達在TDCs細胞胞漿和胞膜中，而LPS誘導的DCs胞膜和胞漿中TLR-2表達明顯減少(圖6)。提示rmGM-CSF和rmIL-4誘導的CD11b+F4/80+TDCs可表達抑制性酶IDO和TLR-2，而顯示耐受潛能。

2.5 CD11b+F4/80+TDCs培養(yǎng)上清中 IL-10和TGF-β1水平 ELISA法測定骨髓源 CD11b+F4/ 80+TDCs培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β1的表達。結果顯示rmGM-CSF和rmIL-4誘導的TDCs培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β1水平較高，明顯高于 LPS誘導的mDCs培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β1水平(圖7)。

圖3 CD83在CD11b+F4/80+TDCs和LPS誘導的mDCs的表達Fig.3 Expression of CD83 in CD11b+F4/80+TDCs and LPS-induced mDCs

圖4 流式細胞術分析MHCⅡ在CD11b+F4/80+TDCs和LPS誘導的mDCs的表達Fig.4 Evaluation of MHCⅡ expression in CD11b+F4/ 80+TDCs and LPS-induced mDCs by flow cytometry

3 討論

圖5 IDO在CD11b+F4/80+TDCs和LPS誘導的mDCs的表達Fig.5 Expression of IDO in CD11b+F4/80+TDCs and LPS-induced mDCs

圖6 TLR-2在CD11b+F4/80+TDCs和LPS誘導的mDCs的表達Fig.6 Expression of TLR-2 in CD11b+F4/80+TDCs and LPS-induced mDCs

圖7 CD11b+F4/80+TDCs和LPS誘導的mDCs培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β1的水平Fig.7 Level of IL-10 and TGF-β1 in CD11b+F4/80+ TDCs and LPS-induced mDCs

DCs前體細胞主要來自外周血和骨髓，主要為CD14+外周血單個核細胞以及CD34+干細胞，且來源于不同前體細胞的DCs功能上有一定的區(qū)別，研究顯示，與外周血前體細胞來源的DCs相比，骨髓來源的 DCs更適合于培養(yǎng) TDCs[13，14]。因此本實驗采用小鼠骨髓來源的前體細胞誘導培養(yǎng)TDCs。

細胞因子在體外誘導培養(yǎng)TDCs過程中起關鍵作用，rmGM-CSF促進DCs發(fā)育和分化，是最重要的細胞因子，但是也會引起其他雜細胞(中性粒細胞和巨噬細胞)的大量增殖，降低DCs的純度;IL-4能抑制中性粒細胞和巨噬細胞的分化，體外聯(lián)合采用rmGM-CSF和rmIL-4能產(chǎn)生大量高純度的iDCs[15-17]。但此時尚殘存有部分雜細胞，并且部分DCs可能不表現(xiàn)耐受特性，影響對TDCs的研究。本實驗聯(lián)合采用rmGM-CSF和rmIL-4成功誘導了小鼠骨髓源iDCs，并采用流式細胞分選系統(tǒng)分離純化得到的具有CD11b+F4/80+表型的TDCs，細胞純度到達99%。圖1中可見骨髓前體細胞培養(yǎng)5～6 d，細胞呈卵圓形，半貼壁簇狀生長，少數(shù)細胞形態(tài)不規(guī)則，同時表面出現(xiàn)較多毛刺樣突起。

mDCs高表達共刺激分子(如MHCⅡ、CD80/ CD86)，分泌炎癥性細胞因子(如IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-15、IL-18等)，刺激T細胞增殖和分化，誘導正向免疫應答。TDCs低表達共刺激分子(如MHCⅡ)，高表達CD11b，抑制初始CD4+T細胞活化并通過阻滯Th17的分化促進外周耐受的形成[4，18-20]。APC表達的F4/80蛋白不僅僅是細胞發(fā)育和分布所需，而且還攜帶免疫耐受信號，誘導外周免疫耐受。CD11b+F4/80+TDCs被認為是一種耐受性DCs，能抑制效應性T細胞(Th1、Th17等)的活化并限制炎性細胞因子(IFN-γ、IL-12 等)分泌[21]。本實驗采用rmGM-CSF和 rmIL-4聯(lián)合誘導，CD11b+F4/80+TDCs百分含量在20%左右。

CD83和MHCⅡ是與mDCs相關的表面分子，CD83特異性表達于mDCs上，而MHCⅡ是高表達在mDCs上的重要抗原呈遞分子[22]。本實驗采用免疫組化法測定骨髓源TDCs中CD83的表達，流式細胞術測定MHCⅡ類分子的含量，結果顯示rmGMCSF和 rmIL-4誘導的 CD11b+F4/80+TDCs，CD83表達缺乏、MHCⅡ類分子低表達，而 LPS誘導的mDCs大量表達CD83、MHCⅡ類分子高表達。IDO通過色氨酸代謝物，如3-HAA，促進Treg的分化和TDCs中 TGF-β1 的表達[23，24]。TDCs高表達 TLR-2，通過下游信號，進而誘導Treg的產(chǎn)生[25]。IL-10及TGF-β1是 TDCs分泌的重要可溶性分子，通過PI3K/Akt/NF-κB-MyD88/MAPK-和 Ras/Raf/MAPK-途徑抑制TDCs的成熟和活化[26]，并且有研究發(fā)現(xiàn)轉染IL-10和TGF-β1基因的DCs能成功表現(xiàn)耐受特性，TDCs通過產(chǎn)生高水平的IL-10和TGF-β1抑制效應性T細胞活化并促進Treg的分化[27]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)骨髓源 CD11b+F4/80+TDCs高表達IDO和TLR-2，TDCs培養(yǎng)上清表達高水平的IL-10和TGF-β1，因此 rmGM-CSF和 rmIL-4聯(lián)合誘導的CD11b+F4/80+TDCs表現(xiàn)耐受特性。

綜上所述，盡管有關DCs的體外分離方法多有報道，目前常規(guī)方法對小鼠骨髓源TDCs的純化和鑒定的方法尚無報道，本實驗采用流式細胞術分選具有CD11b+F4/80+表型的DCs，并提供了一種對CD11b+F4/80+TDCs鑒定的方法。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，CD11b+F4/80+TDC具有形態(tài)典型且具有耐受潛能的特點。為進一步將CD11b+F4/80+TDCs用于炎癥免疫性疾病的細胞免疫治療的研究奠定基礎。

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[收稿2013-09-20 修回2013-12-12]

(編輯 倪 鵬)

Isolated culture and functional identification of mouse bone marrow derived tolerogenic dendritic cells

FU Jing-Jing，SHENG Kang-Liang，LI Ying，LI Pei-Pei，WANG Qing-Tong，CHEN Jing-Yu，WU Hua-Xun，ZHANG Ling-Ling，WEI Wei.Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，Key Laboratory of Antiinflammatory and Immune Medicine(Anhui Medical University)，Ministry of Education，Hefei 230032，China

Objective:To establish the methods of isolated culture and functional identification of mice bone marrow derived tolerogenic dendritic cells(CD11b+F4/80+TDCs)in vitro.MethodsMice bone marrow cells were isolated and cultured to obtain iDCs with the simulation of mouse rmGM-CSF and rmIL-4.CD11b+F4/80+TDCs were purified by fluorescence-activated cell sorting on day 6.The morphological changes of TDCs were observed with the inverted microscope dynamically.The expression of CD11b+F4/ 80+TDCs were analyzed by the flow cytometry.Tolerogenic function of CD11b+F4/80+TDCs was evaluated by the expression of MHCⅡ，CD83，IDO，TLR-2，IL-10 and TGF-β1.The expression of MHCⅡ was analyzed by the flow cytometry，and the expression of CD83，IDO and TLR-2 were analyzed by immune-histochemistry.The levels of IL-10 and TGF-β1 in the supernatant of CD11b+F4/ 80+TDC were analyzed by ELISA.Meanwhile mature DCs(mDCs)induced by LPS were used as control.ResultsThe fresh isolated bone marrow cells look like round and small under microscope.After two days of culture，cells became big and formed into clusters.Five or six days later，cells clusters increased，and the morphology of cells became irregular.At the same time，more dendrite appeared on the surface of cells.The percentage of CD11b+F4/80+TDCs induced by rmGM-CSF and rmIL-4 was about 23%，and the purity of the purified BM CD11b+F4/80+iDC was about 99%.Compared with mDCs，CD11b+F4/80+TDCs expressed low levels of MHCⅡ and CD83 and high levels of IDO，TLR-2，IL-10 and TGF-β1.ConclusionCD11b+F4/80+TDCs derived from mouse bone marrow could be induced successfully by rmGM-CSF and rmIL-4 in vitro.CD11b+F4/80+TDCs showed tolerogenic function by the expressions of IL-10，TGF-β1，IDO and TLR-2.

Tolerogenic dendritic cells;Bone marrow-derived;Isolation;Functional identification

R392.12

A

1000-484X(2014)05-0633-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.014

①本文為國家自然科學基金 (No.81330081，31100640，81173075)和省自然科學基金(No.11040606M195)資助項目。

②共同第一作者。

付靜靜(1988年-)，女，主要從事抗炎免疫藥理學方面研究，E-mail:fujj07@163.com。

及指導教師:張玲玲(1972年-)，女，醫(yī)學博士，教授，碩士生導師，主要從事抗炎免疫藥理學方面研究，E-mail:llzhang@ahmu.edu.cn。