劉 磊 方艷秋 齊亞靈 蘆小單 魏海峰 譚 巖 (吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治中心，長(zhǎng)春 130021)

Akt磷酸化在A549細(xì)胞抵抗rsTRAIL蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究①

劉 磊 方艷秋②齊亞靈③蘆小單 魏海峰 譚 巖 (吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治中心，長(zhǎng)春 130021)

目的:研究Akt磷酸化抵抗rsTRAIL蛋白誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞株凋亡的作用機(jī)制。方法:rsTRAIL蛋白和哌立福新單獨(dú)和聯(lián)合作用于細(xì)胞株A549，Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞中Akt磷酸化水平變化、c-FLIPLL表達(dá)水平變化、caspase-8蛋白活化變化情況。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞增殖率。結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示，rsTRAIL蛋白可以導(dǎo)致A549細(xì)胞中Akt磷酸化水平的增加，哌立福新能夠抑制A549細(xì)胞中Akt的磷酸化水平及c-FLIPLL表達(dá)水平，增強(qiáng)A549細(xì)胞中caspase-8的活化。哌立福新能提升rsTRAIL蛋白誘導(dǎo)A549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率至(76.5±3.02)%和殺傷活性到(83.2±2.54)%。結(jié)論:Akt磷酸化是導(dǎo)致A549細(xì)胞對(duì)抵抗rsTRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要原因，抑制其活性可以促進(jìn)rsTRAIL蛋白發(fā)揮抗NSCLC的活性。

A549細(xì)胞株;重組TRAIL蛋白;Akt;哌立福新

非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma，NSCLC)占肺癌發(fā)病率的70% ～80%，目前臨床尚未發(fā)現(xiàn)更為有效的臨床化療方案[1]。TRAIL (Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)是一種天然的殺傷腫瘤細(xì)胞因子，能強(qiáng)烈誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞等凋亡，而正常組織細(xì)胞卻對(duì)其不敏感[2]。研究證實(shí)，rsTRAIL蛋白可以有效地誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞株的凋亡發(fā)生[3]，同時(shí)在實(shí)體腫瘤臨床實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤效應(yīng)[4]。部分腫瘤細(xì)胞對(duì)TRIAL誘導(dǎo)凋亡的抵抗效應(yīng)是制約著其在臨床應(yīng)用研究廣泛深入的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡信號(hào)通路中部分蛋白功能的失活導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抵抗TRAIL誘導(dǎo)凋亡的主要原因[5]。PI3K(Phosphatidylinositol3-kinase)/Akt信號(hào)途徑參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。Akt的磷酸化可以通過增強(qiáng)c-FLIPL蛋白水平而導(dǎo)致caspase8失活，進(jìn)而導(dǎo)致TRAIL凋亡信號(hào)通路的傳遞的中斷[6]。本研究以NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞為模型，選擇Akt的磷酸化的靶向抑制劑哌立福新聯(lián)合rsTRAIL蛋白共同作用于腫瘤細(xì)胞，探討靶向抑制Akt活性能否增強(qiáng)rsTRAIL蛋白誘導(dǎo)NSCLC的細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。重組rsTRAIL蛋白由本研究室表達(dá)純化[3]。IMDM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司)。小牛血清(杭州四季青生物材料公司)。哌立福新/Perifosine(Selleck Chemicals LLC公司)，Annexin-V-FITC 和PI染料，兔抗 AKT、兔抗磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)，鼠抗人anti-caspase8，鼠抗人anti-cFLIPL，兔抗人β-actin單克隆抗體(Santa Cruz公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma)生物素標(biāo)記的馬抗小鼠IgG和小鼠抗兔IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，購自北京晶美公司。

1.2 藥物干預(yù)分組 對(duì)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，進(jìn)行以下分組干預(yù)。①用100 ng/ml的rsTRAIL蛋白處理12 h(TRAIL組);②用10 μmol/L哌立福新作用24 h后加入100 ng/ml的rsTRAIL蛋白處理12 h(哌立福新組);③未進(jìn)行干預(yù)組(對(duì)照組)，各設(shè)3復(fù)孔。

1.3 Western blot檢測(cè)各類蛋白的表達(dá)水平 收取細(xì)胞并用裂解液獲取總蛋白，測(cè)定各組細(xì)胞蛋白含量并將蛋白樣品濃度調(diào)整為10 μg/μl。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜2 h，10%脫脂奶封閉液1 h。棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的一抗工作液(依據(jù)檢測(cè)蛋白的不同而異)，4℃振搖孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液室溫下孵育2 h。TBST液洗膜×3次，加入50 μl DAB，室溫下顯色15 min。以β-actin作為內(nèi)參照，檢測(cè)各組細(xì)胞Akt蛋白、p-Akt蛋白、c-FLIPLL和 caspase-8活化，采用BandScan5.0分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4 MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞增殖抑制率 獲取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×105ml-1，并接種于96孔板，每孔100 μl，待其生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行以下分組干預(yù)。①用100 ng/ml的rsTRAIL蛋白處理12 h(TRAIL組);②用10 μmol/L哌立福新作用24 h后加入100 ng/ml的rsTRAIL蛋白處理12 h(哌立福新組);③未進(jìn)行干預(yù)組(對(duì)照組)，各設(shè)3復(fù)孔。各組干預(yù)后，每孔加入新配制的5 mg/ml的 MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清后加150 μl DMSO溶解，混勻后在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定 Annexin-V/FITC與PI匹配標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x-±s表示，兩組間參數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)采用方差分析，P＜0.05為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

圖1 A549細(xì)胞中Akt磷酸化水平，c-FLIPL表達(dá)水平及caspase-8活化變化Fig.1 Expression of p-AKT，c-FLIPLand caspase-8 in A549 cells

圖2 A549細(xì)胞p-Akt，c-FLIPL和caspase-8表達(dá)Fig.2 Expression of p-Akt，c-FLIPLand caspase-8 in A549 cells

2.1 A549細(xì)胞的Akt磷酸化水平，c-FLIPL表達(dá)和caspase-8活化 Western blot結(jié)果顯示，100 ng/ml rsTRAIL蛋白處理A549細(xì)胞12 h后，A549細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)較對(duì)照組有增加的現(xiàn)象，說明TRAIL引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致p-Akt表達(dá)改變。哌立福新預(yù)處理24 h后的細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt水平顯著受到抑制，rsTRAIL蛋白作用后Akt磷酸化明顯低于正常水平，說明Akt特異性抑制劑有效地阻止了活化Akt水平。Akt抑制劑哌立福新作用后，隨著Akt磷酸化水平的降低，c-FLIPL表達(dá)水平降低，活化的caspase-8(43 kD)表達(dá)增加(見圖1)。采用BandScan5.0分析軟件進(jìn)行灰度分析結(jié)果顯示，p-Akt條帶與β-actin條帶灰度比值在各組的比值分別為:對(duì)照組 1.35 ±0.24，rsTRAIL 蛋白單獨(dú)作用組1.76+0.35，派立福新聯(lián)合 rsTRAIL 蛋白組 0.32 ± 0.13，有顯著性差異，P ＜0.05;c-FLIPL與 β-actin 條帶灰度比值在各組分別為:對(duì)照組1.07±0.19，rsTRAIL蛋白單獨(dú)作用組為1.21+0.22，派立福新rsTRAIL聯(lián)合 rsTRAIL蛋白為0.11±0.03，有顯著性差異，P＜0.05;活化的 caspase-8(43 kD)β-actin條帶灰度比值在各組的比值分別為對(duì)照組0.15± 0.04，rsTRAIL 蛋白單獨(dú)作用組為 0.16+0.06，派立福新rsTRAIL蛋白組為0.53±0.15，有顯著性差異，P ＜0.05(圖2)。

2.2 抑制Akt活化對(duì)rsTRAIL蛋白對(duì)A549細(xì)胞殺傷的影響 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，哌立福新聯(lián)合rsTRAIL蛋白(100 ng/ml)可以有效誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，A549細(xì)胞的凋亡率為(76.5±3.02)%，遠(yuǎn)高于單獨(dú)應(yīng)用rsTRAIL蛋白(3.21±0.96)%。MTT結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用rsTRAIL(100 ng/ml)作用A549細(xì)胞 24 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率僅為(5.24± 0.25)%;哌立福新預(yù)處理24 h后，rsTRAIL(100 ng/ ml)對(duì) A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率增加到(83.2± 2.54)%，說明通過靶向抑制細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化可以逆轉(zhuǎn)A549細(xì)胞對(duì)rsTRAIL蛋白誘導(dǎo)凋亡的抵抗作用，促進(jìn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的70% ～80%，多數(shù)病人在診斷時(shí)已屬晚期，聯(lián)合化療的預(yù)后很差。我們前期研究證實(shí)[3]，TRAIL對(duì)NSCLC有很好的抗腫瘤活性，但一些肺癌細(xì)胞株對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡存在耐藥。TRAIL耐藥機(jī)理的探索有利于將TRAIL在臨床的廣泛應(yīng)用。

PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在NSCLC腫瘤化療和放療抗拒中的機(jī)理正逐步被研究揭示[7]。磷酸化是Akt的活化形式，活化的Akt(p-Akt)在抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞的增殖及腫瘤的侵襲方面起著重要的作用，與腫瘤的耐藥也密切相關(guān)[8]。本研究顯示，在NSCLC細(xì)胞株A549中，存在著p-Akt的表達(dá)增高。應(yīng)用rsTRAIL蛋白作用于A549細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)p-Akt的表達(dá)水平進(jìn)一步增高，腫瘤細(xì)胞未能表現(xiàn)出明顯的凋亡現(xiàn)象，提示p-Akt參與著A549細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡抵抗作用。

特異性抑制劑或小RNA干擾阻斷P13K/Akt通路可逆轉(zhuǎn)一些細(xì)胞對(duì)TRAIL的原發(fā)耐藥，增強(qiáng)TRAIL敏感性的研究已在多種腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行[9]。哌立福新(Perifosine)是一雜環(huán)的烷基磷酸膽堿，是Akt的靶向抑制劑，通過降低 Akt的活性，控制眾多Akt的下游信號(hào)的傳遞[10]。Tazzari等[6]證實(shí) Akt的磷酸化是導(dǎo)致THP-1白血病細(xì)胞內(nèi)c-FLIP、XIAP等凋亡抑制蛋白水平增高的主要原因，而c-FLIP、XIAP蛋白表達(dá)的改變是影響細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的重要原因。p-Akt可以作為探索腫瘤細(xì)胞抵抗rsTRAIL蛋白耐藥的重要靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L的哌立福新作用于A549細(xì)胞24 h后就可以有效地抑制Akt的活化，降低p-Akt的表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，p-Akt表達(dá)水平的降低，伴隨著細(xì)胞內(nèi)c-FLIPL蛋白水平的降低。c-FLIPL蛋白是抑制凋亡信號(hào)途徑重要分子caspase-8活化的關(guān)鍵因素。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，RNAi靶向性抑制 c-FLIPL蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了rsTRAIL蛋白對(duì)A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過抑制Akt的活化調(diào)節(jié)c-FLIPL蛋白的表達(dá)，也可促進(jìn)caspase-8活化，增強(qiáng)rsTRAIL蛋白對(duì)A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用。哌立福新聯(lián)合rsTRAIL蛋白對(duì)A549細(xì)胞作用48 h后，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到(83.2± 2.54)%，PI3K/Akt可以作為 NSCLC細(xì)胞抵抗TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究的新靶點(diǎn)。探索PI3K/ Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在rsTRAIL蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，有利于rsTRAIL蛋白在NSCLC治療的研究。

[1]Bareschino MA，Schettino C，Rossi A，et al.Treatment of advanced non small cell lung cancer[J].J Thorac Dis，2011，3 (2):122-133.

[2]Stuckey DW，Shah K.TRAIL on trial:preclinical advances in cancer therapy[J].Trends Mol Med，2013，19(11):685-694.

[3]劉 磊，方艷秋，譚 巖，等.重組可溶性TRAIL表達(dá)及誘導(dǎo)A549和H460wt細(xì)胞凋亡[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，34(2):270-273.

[4]Cretney E，Takeda K，Smyth MJ.Cancer:novel therapeutic strategies thatexploitthe TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/TRAIL receptor pathway[J].Int J Biochem Cell Biol，2007，39(2):280-286.

[5]譚 巖，劉 磊，方艷秋，等.抑制c-FLIPL表達(dá)增強(qiáng)rhTRAIL蛋白殺傷肺癌A549細(xì)胞的研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2012，28(10):890-893.

[6]Tazzari PL，Tabellini G，Ricci F，et al.Synergistic proapoptotic activity of recombinant TRAIL plus the Akt inhibitor Perifosine in acute myelogenous leukemia cells[J].Cancer Res，2008，68 (22):9394-9403.

[7]Papadimitrakopoulou V.Development of PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitors and their application in personalized therapy for non-small-cell lung cancer[J].J Thorac Oncol，2012，7(8): 1315-1326.

[8]Willems L，Tamburini J，Chapuis N，et al.PI3K and mTOR signaling pathways in cancer:new data on targeted therapies[J].Curr Oncol Rep，2012，14(2):129-138.

[9]Pier Luigi Tazzari，Giovanna Tabellini，et al.Activity of recombinant TRAIL plus the Akt inhibitor perifosine in acute myelogenous leukemia cells[J].Cancer Res，2008，68:(22):9394-9430.

[10]Al Sawah E，Chen X，Marchion DC，et al.Perifosine，an AKT inhibitor，modulates ovarian cancer cell line sensitivity to cisplatin-induced growth arrest[J].GynecolOncol， 2013，131 (1):207.

[收稿2013-12-17]

(編輯 張曉舟)

Akt phosphorylation and mechanism of TRAIL-resistance in A549 cells

LIU Lei，F(xiàn)ANG Yan-Qiu，QI Ya-Ling，LU Xiao-Dan，WEI Han-Feng，TAN Yan.Medical Treatment and Experiment Center，Jilin Province Hospital，Changchun 130021，China

Objective:To investigate mechanism of TRAIL-resistance in A549 cells(a cell line of non-small cell lung carcinoma cells)due to Akt phosphorylation.MethodsA549 cells were treated with Akt inhibitor Perifosine and rsTRAIL protein individually and in combination.The expressions of Akt phosphorylation(p-Akt)，c-FLIPLLand caspase-8 were detected by Western blot.The apoptotic rate of the A549 cells treated was detected by flow cytometry and the cell proliferation was evaluated by MTT assay.ResultsA549 cells showed the increased level of Akt phosphorylation mediated by rsTRAIL protein.Treatment with the Akt inhibitor Perifosine induced a suppression of Akt activation in A549 cells and a concomitant decrease in the expression of c-FLIPLL.As a result，Perifosine significantly enhanced TRAIL-induced apoptosis rate of(76.5 ±3.02)%and cytotoxic rate of(83.2 ±2.54)%by promoting the activity of caspase-8.ConclusionAkt activity promotes A549cells survival against TRAIL-induced apoptosis and that the cytotoxic effect of rsTRAIL protein can be enhanced by modulating the Akt phosphorylation in human non-small cell lung carcinoma cells.

A549 cells;rsTRAIL protein;Akt;Perifosine

R733.6

A

1000-484X(2014)05-0630-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.013

①本文受吉林省科技廳基礎(chǔ)項(xiàng)目(No.201115201)、吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(No.20122113)、吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(No.20082036)和吉林省科技廳科技創(chuàng)新項(xiàng)目(No.20082102)的資助。

②通訊作者，E-mail:yq.fang@163.com;E-mail:qiyaling87016@ 163.com。

③佳木斯大學(xué)，佳木斯154007。

劉 磊(1978年-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腫瘤免疫相關(guān)研究。

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·