楊 爭,戎曉娟,曹俊涵,馬玉潔,李詩草,楊 紅

（1.中國醫(yī)藥集團總公司四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052；2.成都市食品藥品檢測中心，四川 成都 610045）

高效液相色譜法測定注射用鹽酸瑞芬太尼有關物質

楊 爭1,戎曉娟1,曹俊涵2,馬玉潔1,李詩草1,楊 紅1

（1.中國醫(yī)藥集團總公司四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052；2.成都市食品藥品檢測中心，四川 成都 610045）

建立高效液相色譜法測定注射用鹽酸瑞芬太尼的有關物質，色譜柱采用Kromasil氰基柱，流動相為0.03mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0）-甲醇-乙腈（80∶16∶4），檢測波長225nm。鹽酸瑞芬太尼在0.5046～1009.2μg/mL范圍內與雜質峰面積顯示有良好的線性關系（r=0.9999），最低檢出限為0.001μg。該法簡便、準確，專屬性強，可用于注射用鹽酸瑞分太尼有關物質測定。

鹽酸瑞芬太尼；高效液相色譜；測定

0 引 言

鹽酸瑞芬太尼（remifentanil hydrochloride）是一種由酯酶代謝的強效阿片受體激動劑，其作用起效迅速且極快消失，給藥劑量小，半衰期短，已逐漸成為鎮(zhèn)痛性麻醉藥市場上銷售份額最大的品種。目前，鹽酸瑞芬太尼及注射用鹽酸瑞芬太尼尚未被國內外藥典收載，國內國家藥品標準有收載[1]，但有關物質的分析方法文獻未見報道。國外文獻報道大多是有關藥代動力學方面研究測定生物樣品中鹽酸瑞芬太尼的HPLC方法[2-5]，由于原國家藥品標準中注射用鹽酸瑞芬太尼有關物質檢查方法主峰保留較小，各峰之間分離度差，本文經研究改進建立的HPLC法測定注射用鹽酸瑞芬太尼的有關物質，分離度高，準確性好，能很好地用于控制本品質量。

1 儀器與試藥

LC-20AB型高效液相色譜儀，包括LC-20AB型泵，SPD-20A型紫外檢測器，SIL-20AC型自動進樣器，LC-solution色譜工作站（日本島津）。

鹽酸瑞芬太尼對照品（中國藥品生物制品檢定所，105℃干燥2 h后使用，含量100.0%，批號171260-200601）。注射用鹽酸瑞芬太尼（四川抗菌素工業(yè)研究所制備），規(guī)格1mg。甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

供試品溶液：取本品，加流動相稀釋制成每1mL中約含0.5mg的溶液，作為供試品溶液。

對照溶液：精密量取供試品溶液適量，加流動相制成每1mL中約含10.0μg的溶液，作為對照溶液。

2.2 色譜條件與測定法

色譜柱Kromisil氰基柱（4.6mm×250mm×5μm）；流動相0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液（以磷酸調至pH 3.0）-甲醇-乙腈（80∶16∶4）；檢測波長225 nm；流速1.0mL/min；柱溫30℃；進樣量20μL。

系統(tǒng)適用性試驗。取瑞芬太尼對照品5mg，置10mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，取此溶液2mL，加2滴0.5mol/L氫氧化鈉溶液，在25℃放置10min后，加2滴0.5mol/L鹽酸溶液中和，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液，取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。理論板數(shù)按瑞芬太尼峰計算應不低于3000；主要色譜峰的出峰順序為雜質A、瑞芬太尼。瑞芬太尼峰與雜質A峰（相對保留時間約為0.82～0.88的）的分離度應大于3.0。

測定法。取本品，加流動相稀釋制成每1mL中約含0.5mg的溶液，作為供試品溶液；再精密量取適量，加流動相制成每1mL中約含10.0μg的溶液，作為對照溶液；取對照溶液20 μL，調節(jié)檢測靈敏度，使主成分峰的峰高約為滿量程的20%。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，除輔料峰外，單個雜質峰的峰面積不得大于對照溶液的主峰面積（2.0%），各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的2.5倍（5.0%）。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 空白輔料分離試驗

取本品及空白輔料，照2.2項下的色譜條件測定，空白輔料峰與主峰完全分離，輔料不干擾測定，其結果見圖1、圖2。

2.3.2 強烈因素破壞試驗

取注射用鹽酸瑞芬太尼1mg規(guī)格一瓶，分別進行高溫、酸、堿和氧化破壞，然后按“2.1”項下供試品溶液配制方法處理，進樣測定。結果見圖3，在相對保留時間為0.86處有一主要降解雜質（簡稱A），主峰與降解雜質峰能達到有效分離，樣品對強光破壞較穩(wěn)定，未見明顯雜質增加。

2.4 線性試驗

運用熱破壞樣品進行線性關系試驗，選用高溫破壞的注射用鹽酸瑞芬太尼樣品考察雜質峰面積（雜質A，相對保留時間為0.86）與進樣濃度之間的線性關系。取熱破壞樣品適量置于容量瓶中，加流動相溶解并稀釋制成0.5046，5.046，25.23，50.46，100.92，252.3，302.3，403.7，504.6，605.5，807.4，1 009.2 μg/mL系列溶液，進樣體積20 μL，記錄色譜圖。以圖3中峰3的面積A對供試品濃度C（μg/mL）進行線性回歸，得回歸方程為：A=525262C-1090.7。供試液濃度在0.5046～1 009.2 μg/mL范圍內與雜質A的峰面積顯示有良好的線性關系，其相關系數(shù)達0.9999。

2.5 檢出限

將注射用鹽酸瑞芬太尼有關物質檢查濃度為0.5mg/mL時，有關物質（和降解產物）可檢出的最低含量為0.01%，最小檢出量（進樣體積20 μL計算）為0.001μg。

2.6 精密度

2%自身對照溶液重復性試驗：精密稱取本品，加流動相制成每1mL中約含10.0μg的溶液，制成2%對照溶液；取此溶液，分別進樣6次，按主峰面積計算對照溶液連續(xù)進樣的RSD為0.26%，方法的重復性符合要求，且2%對照溶液的峰面積在6℃放置19h后測定，主峰面積無明顯變化，說明樣品溶液可穩(wěn)定19h。

對同一批號樣品不同日期稱量，不同儀器，不同操作人員按有關物質檢查方法測定，進行中間精密度試驗，結果見表1，由于雜質含量很低，所以相對標準偏差較大，但檢查方法的精密度能滿足本品有關物質限度檢查的要求。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性

將供試品溶液在25℃下放置，分別于0，0.5，1，2，3，4，6h取樣，進樣測定，記錄色譜圖。結果在放置6h時，主要單個雜質峰面積增大近2倍，說明測定時供試品溶液較不穩(wěn)定，宜臨時新配。

取注射用鹽酸瑞芬太尼，按“2.2”項下方法進行有關物質檢查，結果見表2，說明樣品中存在雜質含量低，純度高，符合質量標準要求。

3 討 論

3.1 流動相配比選擇

甲醇、乙腈分別單獨與磷酸鹽緩沖液配比，以及這兩種有機溶劑混合與磷酸鹽緩沖液組成的流動相，進行樣品的HPLC雜質分析，綜合比較發(fā)現(xiàn)兩種有機溶劑混合的分離效果更好。對不同比例有機溶劑配比進行試驗，結果表明有機溶劑比例偏大導致主峰前的兩個雜質峰重疊，不能分離。

3.2 流動相緩沖溶液pH的選擇

考察流動相在pH為2.5，3.0，4.0，5.0，6.5時，主峰與雜質峰的分離結果表明，pH 6.5流動相配制的供試品溶液不穩(wěn)定；pH 5.0時主峰分叉不對稱；pH

2.5和pH 3.0時分離的雜質峰順序、個數(shù)、大小都基本一致。綜合考慮，選擇pH 3.0。

3.3 檢測波長選定及主峰純度考察

智慧鄉(xiāng)村是農業(yè)、農村智能化建設的重要路徑之一，代表著我國鄉(xiāng)村未來發(fā)展的新方向。智慧鄉(xiāng)村作為一種新興的概念體，是以現(xiàn)代化的互聯(lián)網技術為依托，提高農村地區(qū)生產力水平，改善人地關系，以提高農民的生活水平和建立智能化文化、產業(yè)價值體系為目標，打造以休閑旅游、文化體驗、農耕養(yǎng)殖等多種生產生活方式的新農村，使農村地區(qū)的生產生活方式處于“智慧”的狀態(tài)。智慧鄉(xiāng)村的建設已成為廣大農村地區(qū)干部群眾的迫切需求和期待，將在鄉(xiāng)村發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

將高溫破壞樣品在200～400 nm波長范圍進行DAD二極管陣列紫外掃描檢測，結果表明主成分與雜質A的末端吸收較大，在210～235nm范圍都有相似的紫外吸收譜。樣品主峰的純度因子為999.960。

樣品在波長215，220，225和230nm處測定的有關物質測定峰個數(shù)相差不大，考慮215nm低波長處溶劑峰干擾較大，因此測定波長選225nm為宜。

3.4 注射用鹽酸瑞芬太尼的有關物質定性

國外文獻[2-3]中有提到瑞芬太尼在體內降解或代謝過程中形成去甲氧基化合物（GI90291）和N-脫烷基化合物（GI94219）。在注射用鹽酸瑞芬太尼的質量及穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn)，樣品的HPLC譜圖顯示存在3個雜質峰，有一主要雜質峰（簡稱雜質A）相對保留時間為0.86，雜質A與酸堿破壞產生的主要雜質峰保留時間一致，是一個降解雜質。為了確證雜質A的結構，通過堿降解破壞得到雜質A，再經分離純化后獲得純度大于98%（色譜純度）的雜質A，進行氫譜、碳譜確定為4-（甲氧基羰基）-4-[（1-氧代丙基）苯胺基]-1-哌啶丙酸[6]，即為文獻報道的去甲氧基化合物（GI90291）。

3.5 有關物質測定自身對照法確定

注射用鹽酸瑞芬太尼的主要單個雜質為雜質A，但雜質A對照品無法購買，經制備獲取少量雜質A，試驗測出雜質A相對校正因子為0.939。因此按2010年版中國藥典附錄XI X F藥品雜質分析指導原則規(guī)定[7]，“已知雜質或毒性雜質對主成分的相對校正因子在0.9～1.1的范圍內時，可以用主成分的自身對照法計算含量，超出0.9～1.1的范圍時，宜用對照品對照法計算含量”。又通過對雜質對照品和自身對照法進行樣品有關物質檢查比較試驗，其結果基本一致。在不影響測定結果的前提條件下，為避免制備雜質對照品的繁瑣，使方法快速、簡便，因此注射用鹽酸瑞芬太尼的有關物質測定方法選用不加校正因子的主成分自身對照法[8-9]。

4 結束語

通過上述各項試驗表明，經色譜條件優(yōu)化的注射用鹽酸瑞芬太尼有關物質HPLC檢查方法，對樣品存在的有關物質和降解產物，以及與主成分之間各峰均有很好的分離度。記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，足以完全檢查產品中可能存在的雜質，有效改進了原國家藥品標準注射用鹽酸瑞芬太尼有關物質檢查方法雜質之間分離較差的現(xiàn)象。本方法滿足中國藥典注射用鹽酸瑞芬太尼產品中雜質（有關物質和降解產物）檢查要求，對于更好地控制樣品中有關物質具有較高的靈敏度和準確性，亦可作為本品穩(wěn)定性研究中降解產物含量變化測定的有效方法。

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Determination of related substances in remifentanil hydrochloride for injection by HPLC

YANG Zheng1，RONG Xiao-juan1，CAO Jun-han2，MA Yu-jie1，LI Shi-cao1，YANG Hong1
（1.Sichuan Industrial Institute of Antibiotics of China National Pharmaceutical Group Corporation，Chengdu 610052，China；2.Chengdu Center of Food and Drug Control，Chengdu 610045，China）

A HPLC method wasestablished forthe determination ofrelated substancesin remifentanil hydrochloride.A Kromisil-CN column was used，with the mobile phase of 0.03 mol/L potassium dihydrogen phosphate-methol-acetonitrile （80∶16∶4）and the detecting wavelength of 225 nm.The calibration curve was linear in the concentration range of 0.5046-1 009.2 μg/mL（r= 0.999 9）.And the limit of detection was 0.001 μg.The method is simple，accurate and specific，and it can be used for determining related substances in remifentanil hydrochloride for injection.

remifentanil hydrochloride；HPLC；determination

R971+.2；TQ460.7+2；O657.7+2；TQ463+.3

：A

：1674-5124（2014）04-0056-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.04.014

2013-07-17；

：2013-09-18

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（No2011ZX09401-403-8）

楊 爭（1965-），男，四川成都市人，工程師，主要從事藥物制劑和分析研究工作。