李本祥，董新榮，羅 景

（湖南農(nóng)業(yè)大學理學院應用化學系，湖南 長沙 410128）

隨著能源問題的日益突出，人們對可再生能源越來越重視，加強對木質(zhì)纖維素類可再生資源高值利用研究對解決能源危機具有重要的戰(zhàn)略意義[1-3]。芒屬植物以C4循環(huán)方式進行光合作用，生長迅速，生活周期短，抗逆性強，產(chǎn)量高且纖維素和半纖維素占總量的80%以上，是一種理想制備燃料乙醇的木質(zhì)纖維素原料[4]。但木質(zhì)纖維素由于其結(jié)構(gòu)復雜，纖維素、半纖維素不但被木質(zhì)素包裹，而且半纖維素部分共價和木質(zhì)素結(jié)合，纖維素具有高度有序晶體結(jié)構(gòu)，使其纖維素酶解嚴重受限，因此必須對其進行預處理以去除部分或全部木質(zhì)素，或在一定程度上改變原料物理化學結(jié)構(gòu)，如降低結(jié)晶度，減小聚合度，增加孔隙度和表面積等，以促進酶與底物相互接觸并反應，提高酶解速率和總糖得率[5-7]。目前已知預處理方法有物理法、化學法和生物法等，但每種方法單獨使用其預處理效果和成本都有待改進[8]。三氟乙酸能夠破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)[9]，超聲具有波長較短、能量集中的特點，在各行業(yè)有廣泛的用途，但利用超聲波破壞纖維素晶體結(jié)構(gòu)的報道較少[10]。本研究以三氟乙酸/超聲波聯(lián)合預處理方式處理芒草，考察不同的預處理條件對纖維素晶體結(jié)構(gòu)及酶解效果的影響，為進一步開發(fā)以芒草為原料生產(chǎn)生物乙醇技術(shù)奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 材料

芒草秸稈取自湖南農(nóng)業(yè)大學試驗田，洗凈自然風干后切成1～2cm 的小段，在60℃下干燥36h ,然后用植物粉碎機粉碎，過0.84mm篩, 室溫貯存干燥器中備用。

1.2 芒草秸稈的預處理

取粉碎后的芒草秸桿5g置于250mL具塞磨口瓶中，加入三氟乙酸溶液，置于超聲波發(fā)生器中對試樣進行預處理，考察不同的條件對預處理糖化率和芒草酶解糖化率的影響。

1.3 預處理樣品的酶解

試樣的酶解采用文獻[11]方法。取2g纖維素酶(酶活力15000 U·g-1)溶于1000mL的pH為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中。稱取預處理后的芒草樣品3g置于100 mL碘量瓶中，加入33mL纖維素酶溶液（相當于22mg·g-1），搖勻，置于恒溫水浴振蕩器中，45℃、165r·min-1酶水解 72h，過濾，測濾液中的還原糖，其含量采用DNS 法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 預處理對芒草秸桿組成和結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 XRD分析

XRD曲線可以很好地描述纖維素結(jié)晶的狀況。圖1為預處理前后芒草中纖維素的X衍射圖。由圖1可以看出，預處理前芒草中纖維素在2θ為22.3°和16.1°各有一個主要峰和次要峰。主要峰代表的是002面峰的強度，即結(jié)晶區(qū)的衍射強度，次要峰代表的是無定形區(qū)的強度。樣品經(jīng)過三氟乙酸溶液處理之后，次要峰變成一組強度很低分布很寬的衍射峰，峰形不再尖銳明顯，主要峰強度也明顯降低。說明纖維素經(jīng)過三氟乙酸溶液處理之后，原有晶形受到破壞，結(jié)晶度大大降低，這樣可為纖維素酶解組分中剪切作用最快、效果最好的內(nèi)切酶提供更多更好的作用位點，可加快酶解速率，提高還原糖的轉(zhuǎn)化率，這在后面酶解實驗中得到驗證。同時從圖1（A線）中可以看出，纖維素經(jīng)過三氟乙酸/超聲波聯(lián)合預處理后，次要峰已經(jīng)完全消失，主要峰的強度進一步降低，說明超聲波能夠加速纖維素晶形破壞程度，使芒草中纖維素結(jié)晶度下降更為明顯，經(jīng)三氟乙酸/超聲波聯(lián)合預處理的底物有更好的酶解效果。

圖1 不同預處理方式的纖維素的XRD圖Figur e 1 XRD pat ter ns of cel l ul ose sampl es

2.1.2 FTIR分析

由于芒草中纖維素的官能團和化學鍵在紅外光譜中的特定頻率都已經(jīng)知道，因此通過紅外光譜可以定性和定量分析纖維素中存在的官能團以及它們在預處理前后的變化[12]。預處理前后芒草中纖維素的紅外光譜圖見圖2。從圖2中可以看出，預處理前后纖維素的紅外吸收峰形狀基本相同，但是吸收強度有所不同，表明預處理使纖維素的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。經(jīng)過酸處理后，表征纖維素中-CH，-CH2伸縮振動的波數(shù)為2900cm-1，吸收峰強度降低，表明纖維素大分子中甲基、亞甲基發(fā)生了部分斷裂，采用三氟乙酸/超聲波聯(lián)合預處理時，波數(shù)為2900cm-1的吸收峰強度降低得更明顯，說明對纖維素結(jié)構(gòu)破環(huán)得更為嚴重。波數(shù)1635 cm-1處的吸收峰是表征吸附水的伸展振動，經(jīng)預處理后的纖維素中1635 cm-1處吸收峰強度都要明顯高于未處理的纖維素中此處吸收峰，說明經(jīng)過三氟乙酸溶液特別是在超聲波的輔助作用下預處理后的物料中纖維素都明顯得到潤脹，對水的可及度增加。纖維素的潤脹對提高芒草的酶解效率起著重要的作用。

圖2 不同預處理方式的纖維素的紅外光譜圖Figure 2 FTIR spect ra of as-r eceived untr eated sampl e

2.1.3 SEM分析

進一步利用SEM技術(shù)從宏觀角度對預處理前后的芒草纖維素的形貌進行分析，結(jié)果如圖3所示。未處理的芒草表面結(jié)構(gòu)比較緊密、有序，質(zhì)地也比較堅硬（圖3A），纖維素分子表面十分平滑，結(jié)構(gòu)相當規(guī)整，可見分子的平行排布形式（圖3a）；經(jīng)三氟乙酸溶液預處理后纖維素結(jié)構(gòu)變得蓬松、柔軟，且具有部分微孔（圖3B），纖維素分子表面凹凸不平，有點狀突起并夾雜有小孔洞，纖維素表面蠟質(zhì)及硅晶體受到破壞（圖3b）；在超聲波輔助作用下纖維素顆粒變得細小（圖3C），芒草纖維束發(fā)生斷裂，纖維素晶體受到破損（圖3c）。因此纖維素經(jīng)過預處理后，特別是經(jīng)過聯(lián)合預處理之后，纖維素晶體結(jié)構(gòu)破損，纖維素表面積增加，提高了芒草纖維素與纖維素酶的可及度，從而提高纖維素的酶解效率。

圖3 不同預處理方式的纖維素的SEM圖Figur e3 Scanning el ect r on micr ogr aphs of sampl e

2.2 預處理方式的選擇

圖4 為采用不同預處理方式處理2h后在1.3的酶解條件下（下同）對試樣進行酶解后的效果。從A和B及C和D比較可以看出，在超聲波的輔助作用下預處理試樣的酶解效果明顯好于未使用的，說明超聲波預處理有利于加快芒草的酶水解，主要原因是超聲波具有空化作用，能夠破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，增加試樣的酶解可及率，提高其酶解糖化率。

經(jīng)過以上分析，超聲波能提高纖維素酸處理效果，后面的研究擬在采用超聲波的輔助作用下，用三氟乙酸預處理芒草，考察不同的預處理條件對纖維素酶水解效果的影響。

圖4 不同預處理方式的酶解效果Fig4 Enzymatic hydrolysis efficiency of different pretreated silvergrass

2.3 三氟乙酸濃度對預處理效果的影響

在預處理溫度為30℃，時間為4h，固液比為1∶30情況下，以不同的三氟乙酸濃度處理芒草樣品，然后進行酶解,其結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，在酸處理后濾液中，糖含量隨著酸濃度的提高而升高，這與文獻報道相一致[13]。但對酸處理試樣進行酶解時，其酶解糖化率隨著酸濃度升高而升高，當酸濃度進一步升高時，其酶解糖化率明顯降低。這是因為酸濃度越高，預處理濾液中糖含量升高，消耗纖維素和半纖維素的量增大，預處理后試樣中可供酶解的纖維素和半纖維素的含量相對降低，其酶解得率相應也會降低。同時，隨著酸濃度的升高，生成酶解抑制物如糠醛的含量也會升高，不利于后續(xù)酶解的反應[13-14]。因此，在預處理過程中，以40%的酸濃度比較合適，其處理后試樣酶解糖化率達到64.6%以上。

圖5 三氟乙酸濃度對預處理效果的影響Fig5 Effect of trifluoroacetic acid concentration on the pretreatment ef f ect iveness

2.4 固液比對預處理效果的影響

在預處理酸濃度為40%，溫度為30℃，時間為4h情況下，以不同的固液比處理芒草然后對其進行酶解,其結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，隨著固液比增加，其預處理糖化率和酶解糖化率隨著固液比的升高而升高，預處理糖化率隨固液比提高而增加不明顯，而酶解糖化率隨著固液比的升高而提高，當固液比達到1∶30時，其增加不明顯，故預處理時選擇固液比為1∶30。

圖6 固液比對預處理效果的影響Fig6 Effect of ratio of solid-liquid on the pretreatment effectiveness

2.5 預處理時間對預處理效果的影響

在預處理酸濃度為40%，固液比為1∶30，溫度為30℃的情況下，采用不同的處理時間處理芒草樣品，酶解，其結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，隨著預處理時間的增加，預處理糖化率變化不明顯，而預處理試樣酶解糖化率在預處理時間達到3h以上時，變化不明顯，故選擇預處理時間為3h。

圖7 預處理時間對預處理效果的影響Fig7 Ef f ect of time on t he pr et r eat ment ef f ect iveness

2.6 預處理溫度對預處理效果的影響

在預處理酸濃度為40%，固液比為1∶30，時間為3h，以不同的溫度處理芒草樣品，酶解，其結(jié)果如圖8所示。從圖8中可以看出，隨著預處理溫度的升高，預處理糖化率有所增加，但變化不明顯，而試樣酶解糖化率則明顯降低。當預處理溫度升高時，半纖維素水解所產(chǎn)生的木糖在高溫下會進一步降解為糠醛，糠醛對酶解具有明顯的抑制作用[15]；同時，在高溫下三氟乙酸與葡萄糖發(fā)生酯化反應，所產(chǎn)生的副產(chǎn)物也會對酶解產(chǎn)生一定的抑制作用。根據(jù)紅外譜圖和預處理試樣酶解效果分析，在低溫下進行預處理對試樣酶解效果有利，由于超聲波在空化過程中具有加熱作用，很難維持低溫，故選擇預處理溫度為30℃。

圖8 溫度對預處理效果的影響Fig8 Effect of temperature on the pretreatment effectiveness

3 結(jié)論

三氟乙酸/超聲波預處理芒草能夠有效破壞纖維素的晶形結(jié)構(gòu)，增加纖維素酶與底物的酶解可及度，促進了芒草秸桿的酶解糖化率。在40%三氟乙酸溶液、30℃、固液比為1∶30及超聲波的輔助作用下預處理4h的芒草秸桿，在pH為4.6、加酶量22mg·g-1、45℃下酶解72h，其酶解糖化率可達64.6%。

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