譚雯文，劉亭君

（1.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西礦冶與環(huán)境科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 桂林 541004）

菠蘿又名鳳梨，主要分布在我國(guó)廣西、云南、廣東、海南、臺(tái)灣等地區(qū)，是我國(guó)南方栽培面積最大，產(chǎn)量較多的大宗水果之一，華南地區(qū)年產(chǎn)量超過(guò)110萬(wàn)t[1]。目前國(guó)內(nèi)菠蘿的加工產(chǎn)品主要是糖水菠蘿罐頭、菠蘿果汁，但在加工過(guò)程中幾乎有50%～60%的下腳料——菠蘿皮渣被隨意丟棄[2]，不僅浪費(fèi)了大量的資源，又嚴(yán)重影響加工區(qū)的生態(tài)環(huán)境。據(jù)報(bào)道[3-4]，菠蘿皮渣中含有的營(yíng)養(yǎng)成分與果肉相接近，如何綜合高效地利用廢棄的菠蘿皮，使其變廢為寶，國(guó)內(nèi)外已有很多有益的嘗試，但主要集中在作為發(fā)酵原料生產(chǎn)飲料、果酒，而有關(guān)菠蘿皮抑菌作用的研究，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。

尋找安全有效的天然防腐保鮮劑是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以對(duì)4種常見(jiàn)的食品污染菌的抑菌圈為優(yōu)化指標(biāo)，以丙酮為溶劑對(duì)菠蘿皮進(jìn)行提取，采用正交法確定菠蘿皮有效抑菌成分的提取條件，并研究該條件下提取液的最小抑菌濃度（MIC）,為開(kāi)辟菠蘿皮新用途提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿皮：將新鮮的菠蘿皮切片，于60℃恒溫干燥箱烘24h，粉碎后裝入密封袋室溫保存。

供試菌種：細(xì)菌：大腸桿菌(Escherichia col i)、金黃色葡萄球菌(Staphyl ococcus aureus)；霉菌：黑曲霉（Aspergill us niger）、桔青霉（Penicil lium citrinum）。以上菌種均由桂林理工大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

培養(yǎng)基：大腸桿菌采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌采用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，霉菌采用馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基[5]。

HWS-24電熱恒溫水浴鍋，LSH-150-2振蕩培養(yǎng)箱，SWCJ-IF超凈操作臺(tái)，RE-2000A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TDZZ5-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，SHZD(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，DFY-800高速粉碎機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液的制備

將4種供試菌種接入相應(yīng)的搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，細(xì)菌活化18h，霉菌活化40h，然后再將活化后的菌種轉(zhuǎn)接到相對(duì)應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。用接種環(huán)分別刮取一定量已活化好的菌種于9mL無(wú)菌生理鹽水中，充分搖勻，再用10倍稀釋法將菌懸液稀釋至含菌量為107CFU·mL-1的實(shí)驗(yàn)用菌懸液[6]。

1.2.2 菠蘿皮提取物的制備及工藝條件研究

由于影響菠蘿皮有效抑菌成分提取的因素很多，經(jīng)反復(fù)小試，決定對(duì)料液比、丙酮濃度、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)主要因素，3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，方案見(jiàn)表1[7]。

表1 正交因素水平表

表2 菠蘿皮提取液試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

具體操作如下：稱取粉碎后的菠蘿皮10g，按規(guī)定的料液比加入相應(yīng)濃度的丙酮溶液于具塞三角瓶中，在恒溫水浴鍋中震蕩浸提至規(guī)定時(shí)間，然后3000r·min-1離心5min，用紗布過(guò)濾，取清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至膏狀，再用蒸餾水溶解定容至10mL，其濃度為 1000mg·mL-1（指 1mL提取液相當(dāng)于1000mg菠蘿皮干樣品），最后置于4℃冰箱中保存待用。

1.2.3 提取物抑菌活性的測(cè)定

將15mL經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，靜置冷卻，待凝后加入0.1mL菌懸液于平板上，用無(wú)菌玻璃涂布棒將菌液涂布均勻，制成帶菌平板[8]。然后用無(wú)菌打孔器打出直徑為6mm的孔，在每個(gè)孔加入80 μL菠蘿皮丙酮提取液，以無(wú)菌水做空白對(duì)照，平行3次。細(xì)菌于36℃恒溫培養(yǎng)24h，霉菌于27℃培養(yǎng)48h。觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

按1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，將在最佳提取工藝條件下提取的丙酮菠蘿皮提取物配制成600、400、300、250、200、150、100、 80、 60、40mg·mL-1等系列濃度，參照抑菌活性實(shí)驗(yàn)步驟，以未加提取物的培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)各測(cè)試平板至相應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間，觀察各菌體生長(zhǎng)情況，比較提取物不同濃度溶液的抑菌效果, 每個(gè)濃度做3個(gè)平行。以培養(yǎng)基打孔周圍無(wú)菌生長(zhǎng)的最低提取濃度為該提取物的最低抑菌濃度（MIC）[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交提取過(guò)程因素的變化對(duì)提取物抑菌效果的影響

表3是提取工藝條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從表3中可以看出，菠蘿皮丙酮提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉都有抑菌作用，其中對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，最大抑菌直徑達(dá)(28.40±0.31)mm，抑菌效果為大腸桿菌＞黑曲霉＞金黃色葡萄球菌；而提取物對(duì)桔青霉無(wú)抑菌效果。

表3 提取工藝條件正交試驗(yàn)結(jié)果

2. 2 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

表4～6分別為正交試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌的極差分析表。從表4、5、6中數(shù)據(jù)可知，菠蘿皮丙酮提取物對(duì)大腸桿菌和黑曲霉的抑菌效果最佳的提取工藝條件均為料液比1∶30，丙酮濃度75 %，提取時(shí)間40 min，提取溫度70℃。各因素對(duì)大腸桿菌抑制能力的影響順序?yàn)椋罕獫舛龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間＞提取溫度。對(duì)黑曲霉抑制能力的影響順序?yàn)椋毫弦罕龋颈獫舛龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間。其中丙酮濃度對(duì)結(jié)果的影響比較顯著。而抑菌物對(duì)金黃色葡萄球菌最佳的提取工藝條件為：料液比1∶10，丙酮濃度65 %，提取時(shí)間40 min，提取溫度50℃。各因素對(duì)金黃色葡萄球菌抑制能力的影響大小順序?yàn)椋罕獫舛龋咎崛r(shí)間＞提取溫度＞料液比。

表4 正交試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌的極差分析表

表5 正交試驗(yàn)對(duì)黑曲霉的極差分析表

表6 正交試驗(yàn)對(duì)金黃色葡萄球菌的極差分析表

注：Ki代表各因素i水平下抑菌圈平均值

2.3 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定結(jié)果

表7是菠蘿皮提取物最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果。從表7可知，在各自最佳提取工藝條件下，丙酮菠蘿皮提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉的最低抑菌濃度（MIC）分別為 60、250、100mg·mL-1。

表7 菠蘿皮提取物最小抑菌濃度的測(cè)定

3 結(jié)果與討論

1) 試驗(yàn)證明了菠蘿果皮中含有抑菌物質(zhì)，以丙酮為溶劑提取，提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉等常見(jiàn)的食品污染菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)桔青霉則無(wú)。同一條件下，提取液對(duì)大腸桿菌的抑制效果最強(qiáng)。

2) 通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化丙酮的提取條件，對(duì)大腸桿菌和黑曲霉的抑菌效果最佳的提取工藝條件均為：料液比1∶30，丙酮濃度75%，提取時(shí)間40 min，提取溫度70℃。對(duì)金黃色葡萄球菌最佳的提取工藝條件為：料液比1∶10，丙酮濃度65%，提取時(shí)間40 min，提取溫度50℃。

3) 在優(yōu)化條件下，菠蘿皮丙酮提取物對(duì)大腸桿菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌的MIC分別為60、100、250mg·mL-1。

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