王 婷 ，黃立中 ，肖玉潔 ，羅 勇 ，吳雙華

(1.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，湖南 長沙 410208；2.株洲市中心醫(yī)院，湖南 株洲 412007)

黃芩苷聯(lián)合黃芩素誘導乳腺癌細胞凋亡的機制研究

王 婷1,2，黃立中1*，肖玉潔1，羅 勇2，吳雙華2

(1.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，湖南 長沙 410208；2.株洲市中心醫(yī)院，湖南 株洲 412007)

目的 探討黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應用對乳腺癌細胞凋亡的誘導作用及其相關機制。方法 將不同濃度的黃芩苷、黃芩素以及兩者聯(lián)合作用于人乳腺癌(Michigan Cancer Foundation 7，MCF-7)細胞。檢測上述化合物對乳腺癌細胞的活力、凋亡情況以及凋亡相關蛋白表達的影響。結果 黃芩苷或黃芩素作用于乳腺癌細胞后，與作用前相比細胞生長抑制率顯著升高(P<0.05)；兩者聯(lián)合應用，與兩者單獨作用相比抗增殖作用明顯增強(P<0.05)。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)兩者作用后尤其是兩者聯(lián)用后細胞凋亡顯著增加。蛋白印跡分析顯示黃芩苷和黃芩素聯(lián)合作用后Caspase-3、Caspase-9、Bax和p53的表達增加而Bcl-2表達下降，同時p-38活化亦增加。結論 黃芩苷和黃芩素均能誘導乳腺癌細胞的凋亡，兩者聯(lián)合應用后作用明顯增強，其機制可能與其促進促凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax和p53等的表達，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達有關。

黃芩苷；黃芩素；聯(lián)合治療；人乳腺癌；細胞凋亡

乳腺癌是女性最常見的癌癥之一。占女性癌癥的四分之一，且發(fā)病率呈逐年增加趨勢[1]。雖然近年來治療乳腺癌的方法和手段已經有了很大的進步，但病死率仍很高，侵襲與遠處轉移是其致死的最主要原因。尋找有效、低毒、價廉的治療藥物是目前研究的方向之一。眾所周知，細胞穩(wěn)態(tài)需要細胞增殖和細胞死亡之間的平衡，包括細胞凋亡。腫瘤生長是細胞增殖失控和凋亡不足所致，因此誘導細胞凋亡已成為治療癌癥的一種重要的有效的手段。

從植物中篩選有效抗腫瘤成分一直是抗腫瘤藥物研究的熱點，紫杉醇、長春新堿等藥物的臨床應用激勵更多的學者投入植物藥尤其是傳統(tǒng)中藥有效成分抗腫瘤作用的研究。作為清熱解毒的傳統(tǒng)中藥黃芩的抗腫瘤作用近年受到關注。據(jù)報道[2-4]，黃芩的有效組分黃芩苷或黃芩素有潛在的抗肝臟、前列腺、膀胱腫瘤作用。目前雖有報道其有治療乳腺癌作用[5]，但對于其機制的研究還比較少，因此深入研究其作用機制將有助于了解中藥抗腫瘤的作用靶點及篩選出更有效的藥物。

1 材料和方法

1.1 主要材料與儀器

主要材料：黃芩素(中國藥品生物制品檢定所，純度 99.8%，批號：071012)，黃芩苷(中國藥品生物制品檢定所，純度98.6%，批號:110715-201016)，兩者均充分溶解于二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)中，配制成濃度為5 000μg/L的貯存液，避光，4℃保存?zhèn)溆?。根?jù)前期預實驗的研究結果，使用時用細胞培養(yǎng)液稀釋成所需的濃度。DMSO的終濃度≤0.2%。兔抗人Caspase-3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)、Caspase-9(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9)、Bcl-2(B cell lymphoma 2，Bcl-2，B 細胞淋巴瘤基因-2)、Bax(Bcl-2 Associated X Protein，Bax,Bcl-2 相關x蛋白)、p53

和p-p38 MARK(磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶，p-p38)多克隆抗體均購自上海研晶生化試劑有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG購于北京中杉金橋。主要儀器：電泳和凝膠成像分析系統(tǒng)(北京東南儀誠實驗室設備有限公司)；轉膜儀(GE公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(普朗醫(yī)療器械公司)；流式細胞儀(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 乳腺癌(Michigan Cancer Foundation 7，MCF-7)細胞購自湘雅醫(yī)學院中心實驗室細胞庫。將MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。置于37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。細胞處于對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗，每組實驗重復3次。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力 MCF-7細胞接種于96孔培養(yǎng)板(1.0×104個／孔)過夜，加入不同濃度的黃芩苷、黃芩素、黃芩苷和黃芩素（具體濃度見表1），培養(yǎng)72 h后，加入 20 μL 0.5%MTT液 37℃培養(yǎng)4 h后，離心，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，將培養(yǎng)板低速振蕩10 min。酶聯(lián)免疫檢測儀波長490 nm處測量各孔的光密度值(OD)。細胞生長抑制率(%)=(1-OD藥物組/OD空白對照組)×100%，DMSO溶劑為空白對照組。

1.2.3 Western blot檢測相關蛋白表達(1)收集細胞蛋白：細胞培養(yǎng)同前，過夜后加入黃芩苷(22.3μg／mL)、黃芩素(6.8μg／mL)或兩者的聯(lián)合(黃芩苷22.3μg／mL+黃芩素 6.8μg／mL)，并設溶劑空白對照，藥物干預48 h后，收集細胞，加入適量細胞裂解液和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)裂解，收集蛋白質液，BCA 法測蛋白濃度。(2)蛋白免疫印跡分析(Western blot)：灌制12%的分離膠和4%的濃縮膠；將蛋白樣品放入100℃的離子浴中5 min；按每泳道等量蛋白配置相應的上樣體系；向各泳道中加入蛋白樣品及分子量Marker，以GAPDH作為內參。電泳后剝膠，轉膜。1∶200 稀釋一抗(Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Baxp53、p-p38)并將稀釋液與轉印膜共同孵育，室溫2 h，取出轉印膜，漂洗后，1∶800稀釋二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，并將稀釋液與轉印膜共同孵育，室溫2 h；取出轉印膜，漂洗，底物化學發(fā)光ECL顯色。將膠片拍照，應用FluorChenm Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)(美國Alpha)分析目標條帶和內參條帶光密度值，目的蛋白相對含量=目的蛋白光密度值／GAPDH光密度值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 Annexin VFITC／PI雙染色法檢測乳腺癌細胞凋亡和細胞周期。MCF-7細胞培養(yǎng)在6孔板至70%～80%的融合，分別用黃芩苷(22.3μg/mL)、黃芩素(6.8μg/mL)及兩者聯(lián)合處理 12、24、48 h， 收集懸浮細胞 (1～5)×106／mL，PBS 洗 2 次， 加入 400 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后室溫避光孵育 15 min。 加 10 μL PI染色液(50μg/mL)，混勻，避光放置5 min。30 min內流式細胞儀檢測，以Annexin V-FITC+PI-作為細胞早期凋亡標志，計算各藥物濃度下MCF-7細胞的凋亡率，凋亡率：凋亡細胞數(shù)／(凋亡細胞數(shù)十正常細胞數(shù))×100%

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSSl6.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用“”表示，多個均數(shù)間比較采用方差分析（析因設計資料方差分析和重復測量資料方差分析)，多組間每兩兩比較采用SNK法，多組分別與一個對照組比較采用Dunnet-t法，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測黃芩苷、黃芩素對MCF-7細胞生長的影響

2.1.1 不同濃度黃芩苷、黃芩素對MCF-7細胞生長的影響 與空白對照組相比，單用黃芩苷或黃芩素作用MCF-7細胞的生長抑制率均增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著黃芩苷或黃芩素藥物作用濃度的增加，MCF-7細胞的生長抑制率逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，當黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應用后細胞生長抑制率分別與相應的同濃度黃芩苷或黃芩素單獨作用相比顯著增加(P<0.05)。通過析因分析顯示兩者之間存在交互作用(P<0.05)。見表1。2.1.2 兩者聯(lián)合對MCF-7細胞生長的影響 黃芩苷、黃芩素及兩者聯(lián)合作用于MCF-7細胞24、48、72 h，分別測定細胞活力。黃芩苷或黃芩素單獨作用及聯(lián)臺應用后細胞生長抑制率增加，且隨作用時間的延長抑制率明顯增加，尤以兩者聯(lián)合作用72 h對MCF-7細胞抑制最為明顯。結果見表2。

表1 MTT法檢測不同濃度黃芩苷、黃芩素對MCF-7細胞生長率的影響 （，n=10，%）

表1 MTT法檢測不同濃度黃芩苷、黃芩素對MCF-7細胞生長率的影響 （，n=10，%）

注：不同濃度黃芩苷間比較*F=12.004，P=0.000；不同濃度黃芩素間比較*F=21.939，P=0.000；黃芩苷與黃芩素交互作用F=1.725，P=0.041。

黃苓素*（μg/mL）黃苓苷（μg/mL）#0 0 6.8 13.5 27.0 54.0 5.4±4.0 13.9±6.8 29.1±14.4 53.8±13.0 57.4±9.6 22.3 17.7±7.5 41.3±15.7 51.9±18.0 57.6±17.3 59.1±22.9 33.5 27.4±10.3 43.2±16.4 52.5±17.7 56.7±18.7 59.9±20.7 44.6 39.4±13.7 48.5±19.9 55.3±20.5 59.4±20.9 59.3±23.5 89.3 50.6±15.4 56.8±21.4 57.6±20.7 60.0±20.9 60.5±22.9

表2 MTT法檢測黃芩苷、黃芩素對MCF-7細胞生長抑制率的比較 （n=10,,%）

表2 MTT法檢測黃芩苷、黃芩素對MCF-7細胞生長抑制率的比較 （n=10,,%）

注：不同組別間比較*F=69.117，P=0.000；不同時間點間比較#F=25.055，P=0.000。

時間點#組別*空白對照黃芩苷黃芩素兩者聯(lián)合24 h 6.8±3.1 7.6±4.0 9.4±4.7 19.6±7.1 48 h 4.3±2.4 9.8±4.7 12.5±5.3 35.2±10.3 72 h 5.4±3.2 17.7±6.6 13.9±7.2 41.3±12.8

2.2 黃芩苷、黃芩素對MCF-7細胞相關蛋白質表達影響的比較

與空白對照組比較，黃芩苷或黃芩素單用組Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、p53 等各蛋白表達水平均無顯著性差異，而在兩者聯(lián)合組觀察到Capase-3、Caspase-9、Bax和p53的蛋白表達明顯增高，同時有Bcl-2水平下降。在p-p38測定中可觀察到與空白對照組相比，黃芩苷或黃芩素單用組有表達增多的現(xiàn)象，而當兩者聯(lián)合時p-p38的表達增加超過2倍以上，顯著高于黃芩苷、黃芩素單獨作用組（P<0.05）。 結果見表 3。

表3 黃芩苷、黃芩素對MCF-7細胞蛋白表達影響的比較 （n=10，）

表3 黃芩苷、黃芩素對MCF-7細胞蛋白表達影響的比較 （n=10，）

注：與空白對照組比較*P﹤0.05，與兩者聯(lián)合組比較#P﹤0.05。

組別空白對照黃芩苷黃芩素兩者聯(lián)合Caspase-3 0.01±0.00 0.05±0.01 0.02±0.00 0.65±0.09*Caspase-9 0.02±0.00 0.03±0.00 0.05±0.01 0.68±0.08*Bcl-2 1.00±0.00 0.92±0.08 0.98±0.06 0.55±0.02*Bax 1.00±0.00 1.02±0.05 1.07±0.07 1.50±0.17*p53 1.00±0.00 0.98±0.11 0.97±0.10 1.35±0.14*p-p38 1.00±0.00 1.30±0.09#1.50±0.12#2.75±0.19*

2.3 流式細胞術檢測黃芩苷、黃苓素聯(lián)用對MCF-7細胞凋亡率的比較

流式細胞術分析黃芩苷 (22.3μg/mL)、 黃芩素(6.8μg/mL)和黃芩苷(22.3μg/mL)+黃芩素(6.8μg/mL)聯(lián)合作用于MCF-7細胞12、24、48 h后細胞凋亡情況。黃芩苷或黃芩素單獨作用48 h，分別只有2.75%和5.25%的MCF-7細胞發(fā)生凋亡，而兩者聯(lián)合48 h MCF-7細胞凋亡率為分別兩者單用的3.8倍和7.3倍。兩者聯(lián)合在24 h和48 h后MCF-7細胞凋亡率是12 h的94.38倍和154.9倍(結果見表4)。

表4 流式細胞術檢測黃芩苷、黃苓素聯(lián)用對MCF-7細胞凋亡率的比較 （n=10,,%）

表4 流式細胞術檢測黃芩苷、黃苓素聯(lián)用對MCF-7細胞凋亡率的比較 （n=10,,%）

注：不同組別間比較*F=734.692，P=0.000；不同時間點間比較#F=718.185，P=0.000。

時間點#組別*黃芩苷黃芩素兩者聯(lián)合12 h 0.02±0.02 0.07±0.02 0.13±0.06 24 h 0.05±0.05 0.20±0.05 12.27±1.68 48 h 2.75±0.92 5.25±1.35 20.14±1.89

3 討論

細胞死亡通常表現(xiàn)為兩種形式：凋亡和壞死，凋亡代表“積極”的程序性細胞死亡，而壞死代表“消極”的細胞死亡。目前誘導癌癥細胞的凋亡已成為抗癌治療的一個關鍵策略。

研究中發(fā)現(xiàn)黃芩苷或黃芩素單獨作用于MCF-7細胞均能產生明顯的抑制作用，且細胞的生長抑制呈現(xiàn)濃度依賴性，這與以往的前列腺癌和膀胱癌[4]的研究結果基本一致。值得注意的是，與黃芩苷或黃芩素單獨作用相比，黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應用更能顯著增加對細胞生長的抑制作用。本研究通過析因分析（見表1）進一步發(fā)現(xiàn)黃芩苷22.3μg/mL和黃芩素6.8μg/mL最低有效濃度聯(lián)合應用既能最大限度地抑制細胞生長，相比于其他更高濃度的聯(lián)合組，其細胞生長抑制率差異沒有統(tǒng)計學意義。故本研究選擇黃芩苷（22.3μg/mL）和黃芩素（6.8μg/mL）的最低有效濃度聯(lián)合應用進行后續(xù)的實驗，以探索兩者聯(lián)合應用的作用機制。

既往研究顯示，黃芩提取物成分黃酮類化合物（包括黃芩苷和黃芩素）對乳腺癌細胞的生長具有抑制作用[3]。國內徐維恒等[4]報道黃芩素能抑制MCF-7細胞的增殖，誘導細胞凋亡的發(fā)生。我們的研究中聯(lián)合了黃芩苷和黃芩素，以了解聯(lián)合應用的效果。通過流式細胞術對MCF-7的細胞在不同時間點的凋亡率分析，發(fā)現(xiàn)黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應用48 h與單用黃芩苷或黃芩素相比，凋亡率分別增加了約10倍或4倍。

通常細胞凋亡包括死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網(wǎng)途徑。其啟動涉及多種外界因素及調節(jié)機制。雖然其詳細機制還未完全闡明，但各種凋亡途徑最終都匯聚于半胱天冬蛋白酶（Caspase）家族。細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應過程。近年的研究表明，通過激活Caspase信號轉導級聯(lián)反應通路能誘導細胞凋亡的發(fā)生[5]。黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應用48 h誘導MCF-7細胞中Caspase-9和Caspase-3的表達。結果表明，Caspase-9和Caspase-3可能是作為黃芩苷、黃芩素聯(lián)合誘導的細胞凋亡機制而被激活。

線粒體途徑的Bcl-2蛋白的過度表達可能導致細胞質凋亡途徑的抑制作用。促凋亡Bcl-2[6]家族成員(如Bax)與抗凋亡Bcl-2家族成員的比例增加，在線粒體外膜的孔隙形成，釋放凋亡線粒體蛋白，激活半胱天冬酶和誘導細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，與黃芩苷或黃芩素單獨作用相比，黃芩苷和黃芩素的聯(lián)合應用后Bcl-2表達降低，Bax蛋白表達增加。說明兩者聯(lián)合誘導的細胞凋亡不僅涉及線粒體途徑，也通過上調Bax和下調Bcl-2起作用。

p53基因是癌癥中最常見的突變基因，其功能作為一個轉錄因子在細胞凋亡中調控下游基因。已有報道，MCF-7細胞誘導p53依賴的凋亡[7]。本研究中，黃芩苷、黃芩素聯(lián)合應用上調p53蛋白水平，表明p53參與了兩者聯(lián)合誘導的細胞凋亡過程。

與黃芩苷或黃芩素單獨作用相比，黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應用增加MCF-7細胞的凋亡，且誘導的細胞凋亡與 Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、p53 有關。已有報道，黃芩苷誘導細胞凋亡涉及MCF-7細胞中Bax和p53蛋白表達上調[8]。研究中我們用最低濃度的黃芩苷或黃芩素單獨作用，不引起明顯的細胞生長抑制，而兩者聯(lián)合應用卻明顯增強。且無論是22.3μg／mL 黃芩苷或是 6.8μg／mL 黃芩素都不能單獨明顯改變某些凋亡相關蛋白的表達。

p38 MAPK參與調控細胞對應激和細胞因子的應答。在許多腫瘤細胞中通過MAPK信號通路調節(jié)細胞存活和凋亡而發(fā)揮抗癌的特性。有報道稱，黃芩素的作用涉及p38 MAPK。然而，MCF-7細胞中黃芩苷和黃芩素聯(lián)合應用是否也通過p38 MAPK機制的研究尚不清楚。研究結果提示，通過p38 MAPK信號通路黃芩苷和黃芩素的結合增加了細胞凋亡。在MCF-7細胞中黃芩苷和黃芩素的聯(lián)合誘導出黃芩苷或黃芩素單獨作用所未能誘導出現(xiàn)的某些凋亡蛋白。

當兩種藥物產生類似療效時，與單個藥物療效簡單之和相比，它們的聯(lián)合作用會產生更大的效果。藥物聯(lián)合的效果可能取決于藥物間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷或黃芩素單獨作用p53、Caspase-9、Caspase-3和Bcl-2、Bax的水平均未發(fā)生明顯改變，提示在低濃度下兩種單體成分對這些凋亡相關蛋白的作用微弱。但當黃芩苷和黃芩素聯(lián)合作用時，這些蛋白的表達上調或下調，提示兩者聯(lián)合的作用機制產生變化，這為研究抗癌藥物提供了新的可行有效的途徑。

總之，黃芩苷聯(lián)合黃芩素應用通過p38 MAPK信號通路增強了MCF-7細胞凋亡。激活Caspase-9和Caspase-3，下調Bcl-2和上調p53和Bax的表達，從而產生抑制腫瘤細胞的作用，為臨床治療提供了新的思路和依據(jù)。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effect and Mechanism of Baicalin and Baicalein Induced Cell Apoptosis in Breast Cancer Cells

WANG Ting1，2， HUANG Lizhong1*,XIA0 Yujie1， LUO Yong2， WU Shuanghua2
(1.College of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine，Changsha,Hunan 410208,China； 2.Central Hospital of Zhuzhou,Zhuzhou,Hunan 412007， China)

Objective To study the breast cancer cell apoptosis is induced by the combination therapy of baicalin and baicalein and its related mechanism.Methods Different concentrations of baicalin，baicalein and combined effects of the two drugs in breast cancer MCF-7 cells,testing drugs on breast cancer cell viability， apoptosis and apoptosis-related protein expression.Results Baicalin or baicalein acting on the breast cancer cells，cell growth inhibition was significantly higher(P＜0.05)；compared with baicalin or baicalein alone,the combination treatment with baicalin and baicalein significantly enhanced the anti-proliferative effect(P＜0.05).Cell apoptosis was significantly increased after treating with baicialin or baicalein especially the combination of baicalin and baicalein.Western blot analysis revealed that the expression of Caspase-3,Caspase-9,Bax and p53were increased.Meanwhile,the level of Bcl-2 expression was decreased.Moreover， the activation of p-38 were increased.Conclusions Baicalin and baicalein could induce the apoptosis of breast cancer cells alonely， while the effects significantly enhanced after the combination with baicalin and baicalein.This mechanism may be related with the drugs activate the expression of apoptosis-related protein Caspases-3,Caspase-9,Bax and p53， down-regulate the level of Bcl-2， and inhibit the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2.

baicalin； baicalein； combination therapy； breast cancer； cells apoptosis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.05.006.023.05

2013－10－08

高等學校博士學科點專項科研基金資助課題(20114323110006)；湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金(湘財教指[2009]70號-09k058)。

王 婷，女，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結合腫瘤學。

*黃立中，男，教授，博士研究生導師，E-mail:hlz992002@163.com。