張曉燕 周 斌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。2011年美國《Chemical Abstracts》雜志公布的最新統(tǒng)計數據顯示，僅2011年美國就將有20萬以上的女性罹患乳腺癌，其發(fā)生率已占據婦科腫瘤的31%［1］。近年來主要組織相容性復合體Ⅰ類相關基因A(MICA)越來越吸引研究者興趣。腫瘤細胞表面表達NK細胞的活化型受體(NKG2D)的配體MICA蛋白，激活NK細胞和CD8+T細胞的細胞毒作用，殺滅腫瘤細胞。隨著腫瘤進展，組織細胞的MICA從腫瘤細胞表面脫落到癌細胞周圍的間質組織及血液中，成為可溶性MICA，下調NK細胞對抗腫瘤細胞的作用，可能是腫瘤免疫逃逸的機制［2，3］。本研究通過檢測乳腺癌組織及血清中MICA表達水平，探討其與乳腺癌進展相關臨床參數的相關性，為臨床診斷提供新的參考，為進一步以MICA為靶點進行乳腺癌免疫治療提供基礎。

材料與方法

1．實驗對象:收集具有明確病理和影像學診斷的乳腺癌患者組織32例，按照1972年國際抗癌協(xié)會修訂的乳腺癌臨床分期法分期，其中Ⅰ期+Ⅱ期15例，Ⅲ期+Ⅳ期18例;同時收集血清56例，患者年齡25～69歲，平均年齡43．5歲;乳腺良性疾病組69例，包括乳腺纖維瘤，乳腺小葉增生等其他乳腺疾病患者，年齡23～67歲，平均年齡45．2歲;筆者醫(yī)院女性健康體檢者75例為正常對照組，年齡21～65歲，平均年齡 41．6 歲。

2．RT-PCR檢測:MICA液氮研磨約1g組織標本，Trizol試劑提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書，將總RNA反轉錄成cDNA后，進行MICA的PCR反應，引物序列為上游:5'-CTGTGCCATACCAGTTAA-3'，下 游:5'-ATCAAGGACCAGAAAGAAGG-3'，產物片段長439bp;PCR反應條件:94℃ 2min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，循環(huán) 35 次，72℃ 延伸5min，4℃保存;PCR產物上樣于1．5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)分析，以MICA和β-actin電泳帶的熒光強度灰度值的比值表示其mRNA的相對表達量。

3．血清MICA檢測:收集各組患者及健康體檢者血清標本，儲藏于-70℃冰箱備用。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測各標本中MICA濃度。

4．統(tǒng)計學方法:運用SPSS 16．0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料應用均數±標準差(±s)來描述，陽性率的比較采用卡方檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．乳腺癌組織MICA PCR結果分析:乳腺癌及癌旁組織MICA PCR電泳結果如圖1所示，乳腺癌病灶組織和相應的癌旁組織陽性表達率分別為81．25%(26/32)和9．38%(3/32)。

圖1 PCR產物電泳結果圖

2．乳腺癌組織MICA mRNA表達水平與臨床病理特征相關性分析:以MICA和β-actin電泳帶的熒光強度灰度值的比值表示其 mRNA的相對表達量，乳腺癌組MICA mRNA相對表達量為1．36±0．18，顯著高于乳腺癌旁組織0．76±0．09;15例Ⅰ期+Ⅱ期乳腺癌組織MICA mRNA相對表達量表示成1．75±0．39，顯著高于Ⅲ期 + Ⅳ期 0．96 ±0．13(P ＜0．01);其表達量與淋巴結轉移無明顯的相關性。

3．血清中MICA的ELISA結果:與56例乳腺癌患者MICA水平相比，乳腺良性病組和健康體檢者其濃度明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。乳腺良性病患者血清MICA較健康體檢者高，無統(tǒng)計學差異(表1)。

表1 各組血清MICA ELISA檢測結果

4．MICA濃度與乳腺癌臨床病理特征相關性:33例Ⅲ期+Ⅳ期乳腺癌患者血清中含量明顯高于Ⅰ期+Ⅱ期，淋巴結轉移者MICA濃度明顯高于未轉移者，MICA濃度與患者年齡和分化程度無明顯相關性，具體情況見表2。

表2 MICA濃度與乳腺癌臨床病理特征相關性

討 論

近年來乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅健康，對乳腺癌的早期診斷是提高生存率和生活質量的關鍵。NK細胞在控制腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，通過識別腫瘤細胞表面活化和抑制性分子標志，從而控制對腫瘤細胞殺傷作用。NKG2D是NK細胞表面一個重要的激活性受體，能識別腫瘤細胞表面主要組織相容性復合體Ⅰ類相關基因A(MICA)，從而激活NK細胞和CD8+T細胞的細胞毒作用，殺滅腫瘤細胞［4］。研究表明早期分化程度較高的腫瘤組織細胞MICA表達量較高，迅速誘導NK細胞殺傷腫瘤細胞發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織MICA mRNA表達水平明顯高于癌旁組織，說明MICA來源于腫瘤組織，可能作為乳腺癌診斷新的潛在標志物。晚期腫瘤細胞表面MICA蛋白脫落釋放到間質及血清中形成可溶性MICA進而引起腫瘤免疫逃逸［5，6］。血清中可溶性MICA可通過ELISA法進行檢測，本實驗中筆者檢測出乳腺癌血清中其水平明顯高于良性疾病和健康體檢者，說明其來自腫瘤組織。隨著腫瘤進一步進展，血清中濃度明顯升高，腫瘤細胞表面的MICA脫落到血清中變成的可溶性sMICA進一步加劇，從而導致其失去介導NKG2D殺滅腫瘤細胞的作用，故可能作為腫瘤逃逸指標［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期+Ⅱ期乳腺癌組織MICA mRNA表達顯著高于Ⅲ期+Ⅳ期，而Ⅲ期+Ⅳ期乳腺癌患者血清中MICA蛋白表達量顯著高于Ⅰ期+Ⅱ期。乳腺癌患者初期腫瘤細胞表面表達MICA，組織中表達水平增高，隨著腫瘤進展，腫瘤細胞表面MICA蛋白脫落釋放到間質及血清中形成可溶性MICA進而引起腫瘤免疫逃逸，此時組織中MICA檢測量降低，而血清中可溶性MICA量升高，血清可溶性MICA隨著分期逐漸升高，削弱了NK細胞對腫瘤細胞免疫抑制作用，可以此為腫瘤免疫治療研究靶點。同時血清中可溶性MICA還與淋巴結轉移相關，可能作為乳腺癌轉移與否的輔助判斷指標。

1 Liu SH，Liu YF，Liou SH，et al．Mortality and cancer incidence among physicians of traditional Chinese medicine:a 20-year national follow-up study［J］．Occup Environ Med，2010，67(3):166-169

2 Zou Y，Stastny P．Role of MICA in the immune response to transplants［J］．Tissue Antigens，2010，76(3):171-176

3 Sanchez-Correa B，Morgado S，Gayoso I，et al．Human NK cells in acute myeloid leukaemia patients:analysis of NK cell-activating receptors and their ligands［J］．Cancer Immunol Immunother，2011，60(8):1195-1205

4 Ashiru O，López-Cobo S，F(xiàn)ernández-Messina L，et al．A GPI anchor explains the unique biological features of the common NKG2D-ligand allele MICA*008［J］．Biochem J，2013，454(2):295-302

5 Bedel R，Thiery-Vuillemin A，Grandclement C，et al．Novel role for STAT3 in transcriptional regulation of NK immune cell targeting receptor MICA on cancer cells［J］．Cancer Res，2011，71(5):1615-1626

6 Kloess S，Huenecke S，Piechulek D，et al．IL-2-activated haploidentical NK cells restore NKG2D-mediated NK-cell cytotoxicity in neuroblastoma patients by scavenging of plasma MICA［J］．Eur J Immunol，2010，40(11):3255-3267

7 Serrano AE，Menares-Castillo E，Garrido-Tapia M，et al．Interleukin 10 decreases MICA expression on melanoma cell surface［J］．Immunol Cell Biol，2011，89(3):447-457