盧舒凡 李慶國 許淑芹

水蛭是我國傳統(tǒng)中藥，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。同時，水蛭也是一味世界性的動物藥，許多國家如埃及、歐洲都有外用活水蛭治病的傳統(tǒng)。直到1884年，才由Haycraft發(fā)現(xiàn)醫(yī)蛭提取物具有抗凝活性，拉開了水蛭素應(yīng)用研究的序幕［1］。目前，我國對水蛭的研究主要側(cè)重水蛭的各種療效和藥理作用，而對有效成分的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于國外，除氨基酸和抗凝活性成分測定外，國內(nèi)大部分蛭類均未見有效成分的報道。在水蛭研究方面，目前存在的兩大問題是物種來源混亂、有效成分不清晰。本研究以廣東菲牛蛭(俗稱“金邊螞蟥”)為材料，分離純化其有效抗凝物質(zhì)，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)分析、藥理藥效研究、劑型研制及應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

材料與方法

1．儀器:JJ-2組織勻漿搗碎機(jī)(江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠生產(chǎn))，SHZ-82恒溫振蕩器(江蘇金壇富華儀器有限公司生產(chǎn))，TGL-16B高速臺式離心機(jī)(上海安亭科技儀器廠生產(chǎn))，中低壓層析柱(上海楚定生產(chǎn))，MSC050杯式超濾器(上海摩速有限公司生產(chǎn))，電泳儀(北京伯樂科學(xué)公司生產(chǎn))。

2．試驗(yàn)藥品:廣東菲牛蛭(廣州水蛭生物科技有限公司生產(chǎn))，DEAE-Sepharose F．F．(Amersham 公司)，SP-120-40/60-ODS-BP(Daiso公司)，凝血酶，纖維蛋白原，蛋白標(biāo)準(zhǔn)marker(均為Sigma公司生產(chǎn))，BCA試劑盒(廣州美津生物技術(shù)公司生產(chǎn))。

3．凝血酶滴定法［2］:在 37．0 ±0．5℃恒溫條件下，吸取樣品20μl，置反應(yīng)板孔中，加入含0．5%牛纖維蛋白原的三羥甲基氨基烷鹽緩沖液200μl，混合均勻，恒溫5min，滴加每1ml中50單位的凝血酶溶液(每分鐘滴加1次，每次5μl，邊滴加邊攪勻)至凝固，記錄消耗凝血酶溶液體積，結(jié)果按下式計算:C2=(C1·V1)/V2，式中C1:凝血酶的單位濃度(單位NIH/ml)，V1:消耗凝血酶體積(單位μl)，C2:樣品的單位抗凝活性(單位ATU/ml)，V2:樣品加入量(單位μl)。

4．廣東菲牛蛭中抗凝物質(zhì)的分離純化［3，4］:(1)粗提:取廣東菲牛蛭冷凍鮮體100g，與5倍量蒸餾水混合，置勻漿攪拌機(jī)中，10000r/min破碎完全，4000r/min冷凍離心20min，收集上清液Ⅰ。上清液Ⅰ加入冷乙醇，調(diào)整乙醇濃度為20%，4℃靜置4h，8000r/min冷凍離心10min，收集上清液Ⅱ。上清液Ⅱ繼續(xù)滴加冷乙醇，調(diào)整乙醇濃度為80%，4℃靜置過夜，8000r/min冷凍離心20min，收集沉淀物，得菲牛蛭活性粗提物。(2)柱層析提純:取菲牛蛭活性粗提物與2倍量pH 6．5 PB緩沖液混合，超聲提取10min，4000r/min離心10min，取上清液上柱。DEAE-Sepharose F．F．陰離子層析柱(2．5cm ×20．0cm)，以 pH 7．0 的 0．02mol/ml PB 為平衡緩沖液，0．10mol/L，0．25mol/L 和 0．8mol/L 氯化鈉溶液進(jìn)行等度洗脫，流速1．2ml/min，以每管8ml收集蛋白質(zhì)峰，254nm紫外線在線監(jiān)測，按凝血確滴定法測定各管蛋白質(zhì)峰的抗凝活性。收集具有抗凝活性的蛋白峰，濃縮除鹽，得菲牛蛭抗凝活性組分。(3)反相柱純化:取菲牛蛭活性組分上柱，ODS反相柱(1．5cm ×40．0cm);洗脫體系 A:25%EtOH-0．05%TFA-0．03%NaH2PO4;B:30%EtOH-0．05%TFA-0．03%NaH2PO4;階段洗脫，流速1m/min，6ml/管;254nm紫外在線監(jiān)測，按“凝血酶滴定法”測定各管蛋白質(zhì)峰的抗凝活性，結(jié)果見圖2。收集具有抗凝活性的蛋白峰，冷凍干燥，得到菲牛蛭抗凝活性多肽。

5．菲牛蛭活性多肽的生化性質(zhì):(1)純度鑒定［5］:采用三羥甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(tricine-SDS-PAGE)分析，4%濃縮膠，15%分離膠，凝膠厚度為1mm。樣品100℃加熱3min使變性。(2)蛋白質(zhì)含量測定:采用BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度。以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，562nm下測定其吸光度。(3)MALDI-TOF-MS/MS鑒定:將電泳凝膠條帶切下，進(jìn)行MALDI-TOF-MS/MS分析。

結(jié) 果

1．柱色譜提純結(jié)果:取菲牛蛭活性粗提物過DEAE-Sepharose F．F．陰離子層析柱(2．5cm ×20．0cm)提純，其紫外在線監(jiān)測及各管抗凝活性結(jié)果見圖1。

圖1 DEAE-Sepharose F．F．層析圖

2．反相柱純化結(jié)果:取濃縮除鹽后得到的菲牛蛭活性組分上ODS反相柱，其紫外在線監(jiān)測及各管抗凝活性結(jié)果見圖2。

圖2 ODS反相柱色譜峰

3．純度鑒定結(jié)果:菲牛蛭活性多肽在電泳結(jié)果顯示為單一條帶(圖3)，這說明分離出的活性多肽是電泳純的單鏈蛋白。以x代表遷移率Rf，y代表相對分子質(zhì)量MW的對數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。y與x之間的直線回歸方程為:y=-1．5606x+4．8616，r=0．995。菲牛蛭活性多肽的Rf值為0．37。由回歸方程計算出相對分子質(zhì)量約為19．2kDa。

4．蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果:蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x)和吸光度(y)的直線回歸方程:y=0．8934x+0．1007，r=0．9999。根據(jù)回歸方程計算每分離純化步驟所得的蛋白濃度、蛋白回收率及活性回收率，結(jié)果見表1。所得菲牛蛭抗凝活性多肽每克蛋白所含單位抗凝活性不低于于2548000ATU。

表1 分離純化各步驟蛋白濃度及活性收率

5．MALDI-TOF-MS/MS鑒定結(jié)果:經(jīng)質(zhì)譜分析，得到菲牛蛭活性多肽電泳各條帶的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting，PMF)，利用 CBNI數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn):Band 7和 Band 8為細(xì)胞色素，score 100;Band 5為嗜熱蛋白，score 78;其他樣品在數(shù)據(jù)庫中未找到相似蛋白，提示所得菲牛蛭活性提取液中所含的抗凝物質(zhì)與已發(fā)現(xiàn)的“水蛭素類”活性多肽結(jié)構(gòu)不同，是一種新型抗凝血活性蛋白。

討 論

目前，報道多采用生理鹽水或低濃度的堿性緩沖液作為勻漿緩沖液，利用“鹽溶”達(dá)到最大程度提取水蛭體內(nèi)蛋白的目的。預(yù)試驗(yàn)過程中以勻漿上清液中溶出總活性為指標(biāo)，考察生理鹽水、蒸餾水和PB緩沖液的差異，結(jié)果表明三者對水蛭抗凝活性物質(zhì)的溶出無統(tǒng)計學(xué)差異?？紤]后續(xù)步驟采用離子柱層析分離，若采用鹽溶液作為勻漿緩沖液，上柱前樣品需經(jīng)過脫鹽處理，因此最終選用蒸餾水作為勻漿緩沖液。

蛋白質(zhì)沉淀最常用的方法有鹽析、有機(jī)試劑沉淀和酸沉淀3種。鹽析沉淀蛋白質(zhì)復(fù)溶性好，但含鹽量高，需進(jìn)一步脫鹽;有機(jī)試劑沉淀與酸沉蛋白質(zhì)純化倍數(shù)高于鹽析，但易引起蛋白變性;酸沉處理的樣品需加入NaOH調(diào)節(jié)pH值后方可用于活性測定。實(shí)驗(yàn)以菲牛蛭活性物質(zhì)回收率為指標(biāo)，結(jié)合含鹽量、活性測定、試劑毒性等因素，最終選用乙醇沉淀蛋白。

從廣東菲牛蛭中分離得到的活性抗凝多肽，運(yùn)用MALDI-TOF-MS/MS測定各蛋白條帶的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting，PMF)，對 NCBI數(shù)據(jù)庫中收載的蛭類FAST圖譜進(jìn)行整理后發(fā)現(xiàn)其中收載的蛭類蛋白序列主要包含3類物質(zhì):細(xì)胞色素、水蛭素類和重組抗凝多肽的序列或引物，而菲牛蛭相關(guān)信息較少。粗提物經(jīng)電泳分離后各蛋白條帶的PMF在數(shù)據(jù)庫未找到相似蛋白，一方面說明了數(shù)據(jù)庫信息量的不足;另一方面也提示研究的目的蛋白與已發(fā)現(xiàn)的“菲牛蛭素”不同，屬新型抗凝蛋白。

實(shí)驗(yàn)以菲牛蛭冷凍鮮體為原材料，結(jié)合超濾技術(shù)、層析技術(shù)進(jìn)行分離純化，全程以凝血酶滴定法和聚丙烯凝膠電泳分析對抗凝活性物質(zhì)進(jìn)行追蹤，獲得菲牛蛭抗凝活性多肽，經(jīng)驗(yàn)證，此工藝路線穩(wěn)定可行。后續(xù)研究將對菲牛蛭抗凝活性多肽進(jìn)行氨基序列分析，探討其抗凝作用機(jī)制。

1 張衛(wèi)，張瑞賢，李健，等．中藥水蛭品種考證及資源可持續(xù)利用發(fā)展探討［J］．中國中藥雜志，2013，38(6):914-918

2 劉曉帆．龜甲、水蛭的品種與質(zhì)量研究［D］．北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2013:61-65

3 汪蜜，劉義梅，陳科力．水蛭抗凝血活性物質(zhì)提取工藝研究概況［J］．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9(3):56-57

4 方富永，苗艷麗，蘇舒華．雙水相萃取-凝膠色譜聯(lián)用法提取菲牛蛭中的水蛭素［J］．中國藥學(xué)雜志，2012，47(7):489-494

5 唐蕓蕓．基于移動反應(yīng)界面的聚丙烯酰胺凝膠電泳及其應(yīng)用研究［D］．上海:上海交通大學(xué)，2013:32-35