李韻秋 匡志鵬 吳繼寧 孔 娜 楊 帆

原發(fā)性肝細胞肝癌(primary human hepatocellular，HCC)是現(xiàn)今常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率在我國有明顯增加趨勢，比歐美國家高5～10倍，是全球發(fā)生率最高的國家［1，2］。有研究顯示，肝癌的發(fā)生、發(fā)展是肝癌細胞無限增殖與凋亡減少的結果，信號轉(zhuǎn)導通路在其中扮演著重要角色，隨著對肝癌信號轉(zhuǎn)導通路研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)肝癌細胞內(nèi)部的某些信號轉(zhuǎn)導通路的激活或抑制與肝癌的發(fā)生、發(fā)展等有著緊密的聯(lián)系。近幾年來，Hedgehog信號通路在肝癌發(fā)生、發(fā)展變化中的作用進行了初步的探索，大多數(shù)報道結果為肝癌發(fā)生與Hedgehog信號通路關系密切，并且是最近探討肝癌機制研究的熱點，但是具體作用尚不清楚［3］。本研究通過觀察HH信號通路成員Shh、Ptch和Smo在化學誘發(fā)小鼠肝癌模型中的動態(tài)表達情況，探討Hedgehog信號通路與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

材料與方法

1．主要試劑與藥品:免疫組織化學用Shh、Ptch和Smo兔抗鼠多克隆抗體(博奧森生物技術有限公司)。SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)?？俁NA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司)。M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大MBI Fermentas公司)。引物由上海生工生物有限公司合成。Real-Master Mix(SYBR Green)(Takara公司)。定量PCR儀為美國MJR公司產(chǎn)品。組織蛋白裂解液及發(fā)光底物試劑盒(上海碧云天Beyotime公司)，蛋白質(zhì)印跡檢測用Shh和Ptch兔抗鼠多克隆抗體(美國Millipore公司)，Smo兔抗鼠多克隆抗體(美國Abcam公司)，GAPDH單克隆抗體和羊抗兔二抗(美國CST公司)。

2．C57BL/6J小鼠肝癌模型制備:小鼠造模階段已在前期實驗中獲得成功，簡要過程如下:選取符合標準的95只正常C57BL/6J雄性小鼠，隨機分為對照組45只及誘癌組50只，對照組僅喂以小鼠顆粒飼料及滅菌普通水，誘癌組采用化學法［二乙基亞硝胺(DEN)/四氯化碳(CCl4)/乙醇］誘發(fā)小鼠肝癌，于誘癌開始后第4周隨機處死誘癌組及對照組小鼠各5只，此后以相同方法處理第6、8、10、12、14、16、18 和 20 周的兩組小鼠，獲取各周期誘癌組和對照組肝組織標本，蘇木精-伊紅(HE)染色鏡檢提示成功誘發(fā)小鼠肝癌，具體步驟參見文獻［4］。

3．免疫組織化學檢測Shh、Ptch和Smo的表達:SP法簡略步驟:組織標本石蠟包埋-切片-脫蠟-抗原修復-滴加一抗4℃過夜-按照試劑說明書二抗孵育-DAB顯色-蘇木素復染-脫水封片。每例切片隨機選取10個高倍視野，根據(jù)陽性細胞百分率及顯色深淺采用半定量積分法分級［5］，評分標準為:(1)陽性細胞百分率:未見陽性細胞者為0分，＜25%為1分，25% ～75%為2分，＞75%為3分。(2)顯色深淺:不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，將以上2項相加最終評定結果，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，＞5分為強陽性(+++)，且陽性結果定義為細胞質(zhì)伴或不伴有細胞膜上呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色Shh、Ptch蛋白顆粒，細胞核伴或不伴有細胞膜上呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色Smo蛋白顆粒。

4．RT-PCR法檢測Shh、Ptch和Smo mRNA的表達:按照試劑盒對組織標本進行總RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄。Shh基因上游引物:5'-AAAGCTGACCCCTTTAGCCTA-3';下游引物:5'-TTCGCAGTTTCTTGTGATCTTCC-3'。Ptch基因上游引物:5'-AAAGAACTGCGGCAAGTTTTTG-3';下游引物:5'-CTTCTCCTATCTGACGGGT-3'。Smo基因上游引物:5'-ATGATGGACCTGTTGCG-3';下游引物:5'-GTTGGCTTGTTCTTCTGG-3'。β-actin基因上游引物:5'-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3';下游引物:5'-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3'。按25μl反應體系進行。反應條件為:95℃30s，95℃ 5s，62．2℃ 30s，共 40 個循環(huán)。得到目的基因及相應內(nèi)參的CT值。

5．Western blot法檢測 Shh、Ptch和 Smo蛋白的表達:內(nèi)參選用GAPDH，實驗簡要步驟:提取組織總蛋白測定其濃度-電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-滴加一抗4℃培育過夜-加入羊抗兔IgG-HRP二抗-洗膜，然后按化學發(fā)光法試劑盒的說明書進行發(fā)光、壓片。

6．統(tǒng)計學方法:統(tǒng)計學分析軟件SPSS 16．0。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．免疫組織化學法檢測結果:對照組小鼠肝組織中未檢測到Shh、Ptch和Smo蛋白的表達(圖1A、圖2A和圖3A)。在誘癌組中，3種蛋白在小鼠肝癌組織中的表達結果為第6周時檢測Shh蛋白的表達為弱陽性(圖1B)，第16周時出現(xiàn)中度陽性(圖1C)，到第20周時Shh蛋白在小鼠肝癌組織中的表達為強陽性(圖1D)。誘癌組小鼠肝癌組織中Ptch蛋白在第8周時的表達結果為弱陽性(圖2B)，第16周時在小鼠肝癌組織中的表達結果為中度陽性(圖2C)，到第20周時表達結果為強陽性(圖2D)。且小鼠肝癌組織中Smo蛋白分別在第10周、第16周和第20周時出現(xiàn)弱陽性、中度陽性和強陽性表達(圖3B～D)。

圖1 免疫組織化學法檢測Shh在化學誘導小鼠肝癌組織中表達情況(×400)

2．實時熒光定量PCR檢測結果:通過已知相對定量方法分析數(shù)據(jù):①改變的倍數(shù)(fold change)=2-ΔΔCT;②ΔΔCT=(CT 靶基因 -CT 內(nèi)參)誘癌組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)實驗組。如表1所示，誘癌組小鼠肝組織和其對應的正常對照組小鼠肝組織的表達顯示:誘癌組與對照組兩者的小鼠肝組織中Shh mRNA和Ptch mRNA的表達在第4周時差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。從第6周開始(包括第6周)，誘癌組中Shh mRNA和Ptch mRNA的表達均明顯高于對照組中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，P＜0．001)。而Smo誘癌組與Smo對照組兩者的小鼠肝組織中Smo mRNA的表達在第4周和第6周時差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。從第8周開始(包括第8周)，Smo誘癌組中Smo mRNA的表達才明顯高于Smo對照組中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，P ＜0．001)。

圖2 免疫組織化學法檢測Ptch在化學誘導小鼠肝癌組織中表達情況(×400)

圖3 免疫組織化學法檢測Smo在化學誘導小鼠肝癌組織中表達情況(×400)

表1 不同誘癌周期小鼠肝組織中Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA分別在其誘癌組的表達與其相對應對照組的表達比較(2-ΔΔCT)

同一對照組中各周期之間的表達顯示:對照組中小鼠肝組織中的Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA 的表達在第4、6、8、10、12、14、16、18、20 周變化均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。而同一誘癌組中后一周期與前一周期之間的表達顯示:Shh誘癌組中，9個階段中，后一周期Shh mRNA的表達水平均顯著高于前一周期的表達水平，表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，P ＜0．001)。Ptch誘癌組中，Ptch mRNA 在第 6周的表達與第4周的表達比較無統(tǒng)計學差異(P＞0．05)，第8周時的Ptch mRNA表達明顯高于第6周(P＜0．05)，第10周時的表達同樣明顯高于第8周(P＜0．05)，第12周的表達與第10周的表達差異卻無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。此后，后一周期Ptch mRNA的表達水平均顯著高于前一周期的表達水平，表達差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．05，P ＜0．001)。Smo誘癌組中，Smo mRNA在第6周的表達與在第4周的表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，第8周時的Smo mRNA表達與第6周時的表達、第10周時與第8周時的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，到第12周時，Smo mRNA的表達與第10周時比較無統(tǒng)計學差異(P＞0．05)。此后，第14周表達明顯高于第12周(P＜0．05)，第16周明顯高于第14周(P＜0．05)，第 18周明顯高于第 16周(P＜0．05)，第20周時達最高，與第18周時比較無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。

從整個誘癌過程可以看出，隨著小鼠誘癌周期的增長，誘癌組的3種mRNA的表達量分別均呈逐步上升趨勢，至第20周時3組誘癌組中三者表達水平均達到各自的最高值，分別是Shh mRNA為15．986±1．784，Ptch mRNA 為 11．272 ± 0．295，Smo mRNA為10．185 ±0．716。

4．蛋白質(zhì)印跡法檢測結果:如圖4所示。以誘癌組中GAPDH(37kDa)(圖4中D1)的表達條帶為準，設定為強表達。3種蛋白在誘癌組小鼠肝癌組織中的表達結果為誘癌組第4周時，未檢測出Shh蛋白的表達，第6周開始出現(xiàn)Shh蛋白的表達，此時表達較弱，從第8周至第20周表達增強，第16周、第18周和第20周時表達的條帶均有增寬(圖4中A1，Shh 45kDa)。誘癌組中Ptch蛋白在第4周和第6周均未檢測出，到第8周時出現(xiàn)較弱的表達，第10周到第14周表達量有所增加，至第16～20周時出現(xiàn)強表達(圖4中B1，Ptch 160kDa)。而誘癌組Smo蛋白到第10周時方檢測出蛋白的表達，隨著誘癌時間的遞增，Smo蛋白的表達量逐漸增多，第20周表達最顯著，條帶明顯增寬(圖4中C1，Smo 86kDa)。以對照組中GAPDH(37kDa)(圖4中D2)的表達條帶為準，設定為強表達。對照組小鼠肝組織中未檢測到Shh、Ptch和Smo蛋白的表達(圖4中A2、B2、C2)。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測Shh、Ptch和Smo蛋白在誘癌組及對照組小鼠肝癌組織中的表達情況

討 論

Hedgehog(HH)信號通路是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導通路，在胚胎的發(fā)育成熟、器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持、組織損傷后的修復和再生、某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤的分化與浸潤中起重要作用，是維持腫瘤干細胞的重要信號通路［6］。最近越來越多的研究顯示，當該通路被異常激活時能導致多種腫瘤形成，如基底細胞癌、胃癌和胰腺癌等［7～9］。HH信號通路的失調(diào)同樣也參與肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展，從肝臟的胚胎發(fā)生上來看，肝臟來源于前腸末端的肝憩室，HH信號通路在胚胎肝細胞增殖和分化調(diào)控中起重要作用，但是隨著肝臟的逐漸形成，HH信號通路相關蛋白也逐漸消失，在正常成人肝臟中，Hedgehog信號通路處于靜止狀態(tài)，不表達或很少表達。但不少研究者發(fā)現(xiàn)，該通路成分在肝癌中出現(xiàn)了異常高表達，在肝癌組織中可見Hedgehog信號通路的異常激活［10］。其中，Shh配體，跨膜蛋白受體Ptch和Smo是Hedgehog信號通路的核心成員。研究表明，Shh基因是編碼一系列分泌蛋白的基因家族，它編碼一系列分泌型信號蛋白，1980年首先在果蠅基因分析中被發(fā)現(xiàn)，其編碼的Shh蛋白是整條信號通路的啟動因子，是Hedgehog信號通路的重要組成部分［11］。Smo基因為原癌基因，編碼的Smo蛋白屬于G蛋白偶聯(lián)受體，有7個跨膜區(qū)，在HH信號通路中發(fā)揮著橋梁作用。有研究認為Ptch可能發(fā)揮抑癌作用，是一個抑癌基因，能特異性抑制Smo的信號轉(zhuǎn)導功能，避免HH信號通路過度活化引發(fā)腫瘤。在沒有Shh配體信號刺激下，Ptch與Smo結合，抑制Smo的活性，該信號通路處于失活狀態(tài)。過多的Shh蛋白表達使Shh蛋白與Ptch蛋白結合，解除了Ptch蛋白對Smo的抑制，Smo被激活，繼而激活轉(zhuǎn)錄因子Gli，進而啟動下游基因的表達，從而調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過建立C57BL/6J小鼠原發(fā)性肝癌動物模型，并采用免疫組織化學法、實時熒光定量PCR技術和蛋白質(zhì)印跡法檢測Shh、Ptch和Smo三者的基因及蛋白在該模型中的定性和定量表達情況，更好地了解Hedgehog信號通路在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中可能的機制。結果顯示，免疫組織化學法、實時熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法在對照組全程均未檢測到Shh、Ptch和Smo的顯著性變化，主要原因是正常肝細胞中三者僅出現(xiàn)微量變化，實驗方法的敏感度使檢測受到限制。誘癌組前期Shh、Ptch和Smo三者的變化也均不明顯:免疫組織化學法顯示，誘癌組Shh、Ptch和Smo蛋白分別在第6周、第8周和第10周才出現(xiàn)弱陽性。實時熒光定量PCR法檢測結果顯示，與正常對照組比較，誘癌組小鼠肝組織中Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA的表達分別至第6周、第6周和第8周開始，才明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．05，P ＜0．001)。

蛋白質(zhì)印跡法檢測結果顯示，誘癌組Shh、Ptch和Smo蛋白分別從第6周、第8周和第10周起出現(xiàn)弱表達。這說明在誘癌前期小鼠肝組織僅為炎癥反應性病變，三者的表達有所上升，但是上升的幅度并不大，由于免疫組織化學法和蛋白質(zhì)印跡檢測結果為定性分析，未能表述出蛋白在量上的變化趨勢，因此表達差異并未檢測出。只有實時熒光定量檢測敏感度高，得到Shh、Ptch和Smo在此期間的變化差異。從第10周開始至第14周，各誘癌組與同一組別同一周期對照組的Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA的表達差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，P＜0．001)。且三者的表達量在此過程中是逐漸增加的趨勢，Shh誘癌組中，后一周期Shh mRNA的表達水平均顯著高于前一周期的表達水平(P＜0．05)，Ptch mRNA和Smo mRNA兩者在第14周期的表達也明顯高于在第12周期的表達(P＜0．05)。在第16周時，小鼠肝組織重度非典型增生。同時免疫組織化學法檢測Shh、Ptch和Smo蛋白表達均呈中度陽性;實時熒光定量PCR檢測Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA的表達大幅度上升。蛋白質(zhì)印跡法顯示三者的目的條帶較前均有所增寬。此后隨著誘癌周期的遞增，Shh、Ptch和Smo的表達在定量和定性方法檢測中均呈上升趨勢，到20時達最盛。此時免疫組織化學法檢測Shh、Ptch和Smo表達均呈強陽性;實時熒光定量PCR 法(計算結果 Shh mRNA 為15．986±1．784，Ptch mRNA 為 11．272 ± 0．295，Smo mRNA 為 10．185 ±0．716)和蛋白質(zhì)印跡法檢測三者表達均達最大化，此時癌組織已經(jīng)形成。

實驗結果提示，化學誘導小鼠肝癌模型建立的過程是一個由量變轉(zhuǎn)化到質(zhì)變的動態(tài)變化過程，簡陋的解釋了Hedgehog信號通路中Shh、Smo和Ptch在分子水平的變化規(guī)律。三者的增長趨勢基本上是同步的，對照組中3種分子的水平變化均不明顯。在誘癌組中，誘癌初期，即第8周前Shh基因表達增加，編碼過多的Shh配體，使得其與稍弱增強表達的Ptch受體結合，Smo的抑制作用被解除，整條Hedgehog信號通路被激活，隨著化學誘癌劑的繼續(xù)作用，三者表達量顯著增加，彼此相互作用，發(fā)揮著正性調(diào)控的作用，致使誘癌達到20周時成功誘發(fā)小鼠肝癌，表達最盛。

綜上所述，正常對照組小鼠肝組織中Shh、Ptch和Smo表達量低而未被檢測出，而在化學誘癌組中Hedgehog信號通路在誘癌的早期就已經(jīng)被激活，其成員Shh、Ptch和Smo表達量的持續(xù)增加所形成的微環(huán)境的不斷變化調(diào)控著小鼠肝癌的發(fā)生、發(fā)展全過程，但確切的調(diào)控機制還有待于進一步深入研究，以及與肝癌中其他信號通路之間的共同調(diào)控作用機制也需要做進一步的探索。本研究模擬人體肝癌模型，對Shh、Ptch和Smo在小鼠肝癌的始動發(fā)生到形成肝癌的過程中的動態(tài)變化規(guī)律的闡述，為將來開展基因工程藥物的研究和肝癌的靶向治療打下良好的基礎。

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