和占龍 禹文海 楊鳳梅 趙 遠(yuǎn) 魯帥堯 王俊斌 陳麗雄 乞素冬 李艷艷 劉龍丁

恒河猴(Rhesus monkey，Macaca mulatta)，屬靈長目(Primates)、類人猿亞目(Anthropoidea)、猴科(Cercopithecidae)、獼猴屬(Macaca)，屬于國家二級保護(hù)動物。其適應(yīng)性強(qiáng)，容易馴養(yǎng)繁殖，生理上與人類較接近，因此是人類醫(yī)學(xué)科研究工作中比較理想的實(shí)驗(yàn)動物，主要應(yīng)用于傳染病學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)、行為學(xué)、老年病、器官移植、內(nèi)分泌病、腫瘤學(xué)等方面研究。恒河猴MHC又稱為RhLA(rhesus macque leukocyteantigen)，其MHC基因命名時加前綴Mamu(Macaca mulatta)，習(xí)慣上直接使用為Mamu。根據(jù)Mamu基因產(chǎn)物功能和結(jié)構(gòu)的不同，又將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類基因。恒河猴的Mamu-Ⅱ類分子與人類一樣，也有3個典型的亞區(qū) DR、DQ、DP［1，2］。與 DQ、DP 相比，DR在細(xì)胞表面有較高的濃度，在免疫反應(yīng)中具有重要作用。恒河猴DRB位點(diǎn)的多態(tài)性之高，是人類和其他靈長類動物中所沒有的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的恒河猴DRB位點(diǎn)的等位基因有126個［3～6］。本研究以來源清晰的云南地區(qū)恒河猴為研究對象，應(yīng)用PCR技術(shù)對部分MHC-DRB等位基因進(jìn)行分析，為今后開展恒河猴群遺傳資源保護(hù)及相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

材料與方法

1．樣品采集和DNA提取:實(shí)驗(yàn)采集云南地區(qū)普通級恒河猴全血共195份，其中昆明自繁猴123份、寧蒗縣26份、景東縣27份和鎮(zhèn)沅縣19份。均來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所全國醫(yī)學(xué)靈長類研究中心［實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SCXK(滇)2010-0006］。靜脈抽取全血2ml，EDTA抗凝。采用AXYGEN DNA提取試劑盒提取基因組DNA，詳細(xì)操作步驟見說明書。

2．PCR擴(kuò)增及測序:參考相關(guān)文獻(xiàn)［7］選取引物對，引物序列見表1。由生工生物工程(上海)有限公司合成。在PCR儀(Bio-Rad C1000)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體積為10μl，上游引物和下游引物各(20μmol/L)0．5μl，模板 DNA 0．5μl，2 ×PCR Master Mix 5μl，ddH2O 3．5μl。反應(yīng)條件為 94℃ 4min，然后 94℃ 1min，64 ～66℃ 45s，72℃ 1min，35 個循環(huán)，最后 72℃延伸7min。用1．5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，參照DNA marker DL2000確定陽性樣品。陽性樣品PCR產(chǎn)物送上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 MHC-DRB各等位基因引物序列

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)利用Excel和SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果:對 DRB1*0303、DRB1*0309、DRB1*0305/06、DRB1*0403、DRB1*1005/07、DRB3*0403、DRB5*0301/02、DRB6*0101、DRB6*0103、DRB6*0104/05、DRB*W101 和 DRB*W201 等12個基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳圖及結(jié)合分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000判斷結(jié)果。本研究以DRB3*0403基因電泳圖來說明，DRB3*0403基因PCR產(chǎn)物大小為243bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。由圖1可以看出，第1、5、9、10號樣品為陽性。

圖1 恒河猴MHC-DRB3*0403基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2．DRB基因的序列分析結(jié)果:將 DRB各基因PCR擴(kuò)增的部分陽性樣品進(jìn)行測序，經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)本研究中測定的序列與GenBank中對應(yīng)序列同源性在92%以上。本研究以DRB3*0403基因測定的序列為例進(jìn)行說明。DRB3*0403基因在GenBank中BLAST比對結(jié)果見圖2，兩者同源性為99%。對比發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)測定的序列在GenBank中對應(yīng)序列(FJ544411)的227位堿基A突變成T、337位堿基C突變成G。

圖2 DRB3*0403基因的對比結(jié)果

3．云南地區(qū)4個恒河猴群各基因的分布情況:云南地區(qū)4個恒河猴群各MHC-DRB基因分布情況見表2。

表2 云南地區(qū)4個恒河猴群MHC-DRB部分基因檢測結(jié)果［n(%)］

由表2可知，寧蒗恒河猴群檢測出了所有的12個基因，檢出率為 3．85% ～57．69%，其中 DRB5*0301/02、DRB6*0104/05、DRB*W101 檢出率最低(3．85%)，DRB6*0103 檢出率最高(57．69%)。來自昆明的自繁猴群除了未檢測出DRB*W201外，均檢測出了其余所有的11個基因，檢出率為1．63% ～42．28%，其中 DRB1*0303 檢出率最低(1．63%)，DRB6*0101檢出率最高(42．28%)。景東群未檢測出DRB1*0403和DRB5*0301/02基因，其他基因的檢出率為3．70% ～33．33%，其中 DRB*W101檢出率最低(3．70%)，DRB3*0403、DRB6*0101、DRB6*0103檢出率最高(42．28%)。鎮(zhèn)沅群未檢出DRB*W201、DRB1*0309和 DRB5*0301/02基因，其他基因檢出率為5．26% ～63．16%，其中 DRB1*0303和DRB1*0403檢出率最低(5．26%)，DRB6*0103 檢出率最高(63．16%)。

卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，DRB*W201在寧蒗群和昆明自繁猴群之間存在顯著性差異(χ2=4．66，P＜0．05)，景東群與昆明自繁猴群之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8．85，P ＜0．01)，其余各基因在 4 個恒河猴群之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＜3．84，P ＞0．05)。

討 論

主要組織相容性復(fù)合體與機(jī)體免疫功能和機(jī)體對免疫相關(guān)疾病的抵抗力密切相關(guān)［8，9］。在抗原遞呈過程中，MHCⅡ類分子參與胞外抗原向CD4+T細(xì)胞的遞呈，大量研究表明許多疾病的進(jìn)展過程與宿主的MHC基因型密切相關(guān)，許多有關(guān)MHCⅡ類分子在HIV-1病毒感染中的作用的報道說明其在控制病毒感染中具有重要作用［10］。

本研究利用PCR-SSP方法對195只云南地區(qū)恒河猴的外周血樣品進(jìn)行了檢測，12個MHC-DRB基因在云南地區(qū)恒河猴群中均有檢出，說明云南地區(qū)恒河猴遺傳多樣性較豐富。在本研究中檢測出的12個基因PCR陽性樣品測序比對與目標(biāo)序列完全一致，說明PCR-SSP方法能較好的用于DRB各基因的分析，這有利于下一步開展大規(guī)模樣品DRB基因攜帶情況分析，從而獲得具有特定基因的恒河猴群篩選和選育提供了基礎(chǔ)，為生物醫(yī)學(xué)相關(guān)研究提供合適的具有特定遺傳背景的實(shí)驗(yàn)動物提供依據(jù)。

1 Kenter M，Otting N，Anholts J，et al．Evolutionary relationships among the primate MHC-DQA1 and DQA2 alleles［J］．Immunogenetic，1992，36(2):71-78

2 Slierendregt BL，Otting N，Anholts J，et al．Gel electrophoretic analysis of rhesus macaque major histocompatibility complexⅡDR molecules［J］．Hum Immunol，1994:4033-4040

3 Doxiadis GG，Otting N，de Groot NG，et al．Unprecedented polymorphism of MHC-DRB region cofigurations in rhesus configurations in rhesus macaque［J］．J Immun，2000，164(4):3193-3199

4 Slierendregt BL，van Noort JT，Bakas RM，et al．Evolutionary stability of transpecies major histocompatibility complex classⅡDRB lineages in human and rhesus monkeys［J］．Hum Immunol，1992，35(1):29-39

5 Slierendregt BL，Otting N，Van Besouw N，et al．Expansion and contraction of rhesus macaque DRB region by duplication and deletion［J］．J Immunol，1994，52(5):2298-2307

6 Lekutis C，Letvin NL．Biochemical and molecular characterization of rhesus monkey major histocompatibility complex classⅡ DR［J］．Hum Immunol，1995，43(1):72-80

7 Lobashevsky A，Smith JP，Kasten-Jolly J，et al．Idengtification of DRB alleles in rhesus mokeys using polymerase chain reactionsequence-specific primers(PCR-SSP)amplification［J］．Tissue Antigens，1999，54:254-263

8 Bontrop RE，Watkins DI．MHC polymorphism:AIDS susceptibility in non-human primates［J］．Trends Immunol，2005，26(4):227-233

9 Benichou G，Kant CD，Madsen J，et al．Modulation of alloreactivity to MHC-derived peptides and transplantation tolerance［J］．Front Biosci，2007，12:4239-4247

10 邱趁麗，楊桂波．用PCR-SSP方法檢測中國恒河猴Mamu-DRB*W101和 Mamu-DRB*W201基因［J］．動物學(xué)研究，2007，28(6):664-669