李 慧 祝 紅 閆 莉 谷婧麗 郝 維 曹濟民

碳納米管由石墨烯片卷曲而成，根據(jù)石墨烯片的層數(shù)，可以將碳納米管分為多壁碳納米管(multiwalled carbon nanotube，MWCNT)和單壁碳納米管(single-walled carbon nanotube，SWCNT)。碳納米管重量輕、比表面積大，是研制藥物遞送載體的良好材料，因其展示的較高的穩(wěn)定性和良好的生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出了無限的應(yīng)用前景［1，2］。有研究報道，碳納米管對骨細胞的增殖分化及骨組織的生成具有明顯的促進作用，能促進神經(jīng)再生和減少神經(jīng)組織瘢痕的產(chǎn)生［3，4］。隨著對碳納米管研究的深入，其生物安全性方面的報道也逐漸受到重視［5～8］。雖然碳納米管對生物有一定的毒性作用，但其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域仍被寄予厚望。目前生物學(xué)界對碳納米管的免疫細胞效應(yīng)仍知之甚少。本工作以來源于小鼠的RAW264．7巨噬細胞系作為吞噬細胞模型，采用熒光素標記的大腸桿菌E．coli k-12(FITC-E．coli k-12)作為吞噬體系，重點研究了MWCNT對巨噬細胞吞噬功能的影響。考慮到碳納米管的可能毒性與劑量和作用時間的關(guān)系，筆者觀察了不同濃度和不同作用時間的多壁碳納米管的功效。

材料與方法

1．細胞和試劑:RAW264．7 巨噬細胞系、Hepes、DMEM(高糖)培養(yǎng)基、雙抗(含青霉素和鏈霉素)及PBS緩沖液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心;胎牛血清購自Gibco公司(USA);6孔板、12孔板等細胞培養(yǎng)耗材購自Corning公司(USA);熒光標記的大腸桿菌吞噬試劑盒(v6694 Vybrant?Phagocytosis Assay Kit)購自Molecular Probes公司(USA)。

2．流式細胞術(shù):常規(guī)培養(yǎng)RAW264．7細胞;選取對數(shù)生長期的RAW264．7細胞，用0．25%的胰酶消化成單個細胞，加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心5min，棄掉上清液，重新加入DMEM完全培養(yǎng)基充分重懸細胞。調(diào)整細胞濃度為5×105/ml，接種到12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1ml，37℃培養(yǎng)。觀察不同濃度MWCNT對RAW264．7吞噬能力的影響:實驗設(shè)置5個濃度，MWCNT的濃度分別為0(對照組)、10、25、50 和 75μg/ml。另設(shè)流式細胞術(shù)的陰性對照組(即RAW264．7細胞吞噬無FITC標記的 DH-5α大腸桿菌)。MWCNT與RAW264．7細胞共同孵育12h。觀察固定濃度(25μg/ml)MWCNT、不同作用時間對RAW264．7細胞吞噬能力的影響:實驗設(shè)置5個時間點，分別為0(對照組)、4、7、9和24h。另設(shè)流式細胞術(shù)的陰性對照組。觀察MWCNT對活化的RAW264．7細胞吞噬能力的影響:實驗設(shè)置5個組，分別為對照組(不加MWCNT，也不加LPS)，LPS組(LPS 10μg/ml)，LPS+MWCNT 25μg/m 組，LPS+MWCNT 50μg/ml組，LPS+MWCNT 75μg/ml組，每組中的相應(yīng)處理因素(LPS，MWCNT)均與RAW264．7細胞共孵育16h。另設(shè)流式細胞術(shù)的陰性對照組。觀察RAW264．7細胞吞噬大腸桿菌:參照熒光素FITC標記大腸桿菌吞噬試劑盒的給定方法，解凍0．5ml HBSS緩沖液，并與FITC標記的大腸桿菌(E．coli k-12)干粉充分混勻，移入含4．5ml去離子水的棕色瓶中，超聲混勻直至大腸桿菌微粒充分分散，于12孔板中每孔加入20μl微粒，陰性對照組加入不帶熒光標記的DH-5α大腸桿菌。然后37℃避光孵育2h，吸棄上清，每孔加入200μl臺盼藍(pH 4．4)，反應(yīng) 1min 以淬滅多余的E．coli k-12微粒。用PBS洗3次，收集細胞，加入500μl PBS充分重懸成單細胞懸液，用200目篩網(wǎng)過濾后，再用Accuri?C6流式細胞儀(美國BD公司生產(chǎn))檢測熒光強度。每個樣本獲取10000個細胞進行分析，已被吞噬的E．coli k-12的熒光強度檢測，采用激發(fā)波長485nm，吸收波長530nm。計算吞噬指數(shù)，即RAW264．7細胞吞噬FITC-tagged E．coli k-12的平均數(shù)量，用平均熒光強度(MFI)表示:MFI=(FIsample-FInegative)/FInegative。公式中，F(xiàn)Isample表示樣本的熒光強度，即RAW264．7吞噬FITC-E．coli k-12后的熒光強度;FInegative表示陰性對照組的熒光強度，即細胞吞噬DH-5α后的熒光強度。此外，筆者也關(guān)注了參與吞噬活動的RAW264．7細胞的百分比情況，用以反映整個RAW264．7細胞群體中參與吞噬活動的細胞比例。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:用SPSS 22．0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組比較用分組檢驗，多組比較用方差分析進行統(tǒng)計學(xué)處理。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．MWCNT劑量依賴性地抑制RAW264．7細胞的吞噬功能:流式細胞術(shù)結(jié)果如圖1所示，對照組的RAW264．7細胞對FITC標記的大腸桿菌有一定的吞噬能力。隨著 MWCNT濃度的遞增(10、25、50和75μg/ml)，RAW264．7 細胞吞噬 FITC-tagged E．coli k-12的量(用平均熒光強度MFI表示)逐漸降低，與對照組相比分別降低了約 17．0%(P＜0．05)、46．6%、62．5%和70．4%(P ＜0．01)。參與吞噬活動的細胞百分比也從對照組的98．6%降低到 MWCNT 75μg/ml組的92．4%(P ＜0．05)。

圖1 流式細胞術(shù)顯示MWCNT濃度依賴性地抑制RAW264．7細胞對大腸桿菌的吞噬能力

2．MWCNT時間依賴性地抑制RAW264．7細胞吞噬大腸桿菌的能力:隨著MWCNT孵育時間的延長(4、7、9、24h)，RAW264．7 細胞吞噬熒光標記大腸桿菌(FITC-E．coli k-12)的量(用平均熒光強度MFI表示)逐漸降低，與對照組相比分別降低了約28．4%、47．8%、63．2% 和 77．1%(P 均 ＜ 0．01)。參與吞噬活動的細胞百分比也逐漸降低，分別為對照組71．2%、MWCNT 4h 組 69．7%、MWCNT 7h 組65．1%、MWCNT 9h 組 52．0%、MWCNT 24h 組43．4%(P ＜0．05)，詳見圖2。

3．MWCNT對活化的RAW264．7細胞的吞噬功能的抑制作用:被LPS(10μg/ml)激活的RAW264．7細胞與靜息RAW264．7細胞相比，吞噬FITC-tagged E．coli k-12的平均熒光強度(MFI)升高了約2．62倍(P＜0．01)。MWCNT能夠抑制活化的RAW264．7細胞的吞噬能力，且隨著MWCNT濃度的升高(25、50、75μg/ml)，活化的 RAW264．7 細胞吞噬大腸桿菌的量逐漸減少;參與吞噬的細胞百分比也逐漸降低，分別為:對照組64．2%，LPS組91．1%(與對照組相比，P ＜ 0．01)，LPS+MWCNT 25μg/ml組 85．4%，LPS+MWCNT 50μg/ml組 75．2%，LPS+MWCNT 75μg/ml組70．7%(3組分別與LPS單獨作用相比，P均 ＜0．01)，詳見圖3。

圖2 流式細胞術(shù)顯示MWCNT時間依賴性地抑制RAW264．7細胞吞噬大腸桿菌的能力

圖3 MWCNT抑制活化的RAW264．7細胞的吞噬功能

討 論

隨著碳納米管在工程學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用的迅速普及，人類和動物接觸和攝入碳納米管的概率也在增加，這勢必增加了碳納米管生物危害性的風(fēng)險［9］。生物體對外源性入侵物質(zhì)(如碳納米管)的第一道防線是免疫系統(tǒng)，巨噬細胞吞噬異物是免除異物傷害的關(guān)鍵因素之一［10］。巨噬細胞與外源性異物的相互作用有兩個方面，一方面是巨噬細胞吞噬和清除異物，另一方面是外源性異物(如碳納米管)對巨噬細胞產(chǎn)生可能的傷害作用或其他效應(yīng)，而對這種傷害作用或其他效應(yīng)目前所知甚少。有研究發(fā)現(xiàn)，MWCNT聚集在小鼠肺部能夠引起顯著的促纖維化反應(yīng)和炎癥，而且能觸發(fā)RAW264．7細胞產(chǎn)生H2O［11］2。每天6h將大鼠暴露在MWCNT氣霧劑中，兩周后支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細胞、肺泡巨噬細胞、白蛋白的量明顯增多［12］。也有報道稱，小鼠吸入MWCNT后，肺泡巨噬細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)MWCNT顆粒，而且一定濃度的MWCNT能夠減弱NK細胞的功能，導(dǎo)致免疫抑制，如T細胞依賴的抗體應(yīng)答和T細胞的增殖能力降低［13］。由此可見，巨噬細胞在碳納米管引起的機體免疫應(yīng)答起到重要作用。但未見MWCNT對巨噬細胞吞噬功能影響的報道。

本工作重點研究了多壁碳納米管對小鼠巨噬細胞系RAW264．7細胞的吞噬功能的影響。筆者觀察了不同的MWCNT濃度和不同的MWCNT孵育時間對靜息RAW264．7細胞吞噬功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)，MWCNT能夠進入RAW264．7細胞，這與之前的研究結(jié)果相一致［13］。同時筆者發(fā)現(xiàn)MWCNT能夠顯著減弱RAW264．7細胞吞噬FITC-E．coli k-12的能力，且呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性。研究中筆者還比較了靜息和LPS激活兩種狀態(tài)下，RAW264．7細胞吞噬功能的變化。結(jié)果顯示，RAW264．7細胞在沒有受到吞噬刺激因子LPS激活的狀態(tài)下，也具有一定的吞噬能力。用LPS激活的RAW264．7細胞，其吞噬能力明顯增強，這與預(yù)期和報道的結(jié)果一致［14］。MWCNT能夠削弱LPS對吞噬的刺激作用，即MWCNT同樣能夠抑制激活的RAW264．7細胞的吞噬能力。

Pisanic等［15］在PC12神經(jīng)細胞上發(fā)現(xiàn) Fe2O3納米材料對細胞骨架的破壞作用。Huang等［16］發(fā)現(xiàn)，長棒行單分散介孔碳納米管使微絲斷裂成無序狀而在細胞膜附近皺縮破壞，從而破壞A375黑素瘤的細胞骨架。筆者認為MWCNT進入巨噬細胞后可能由于其三維結(jié)構(gòu)的原因，對細胞骨架產(chǎn)生了一定的影響，進而阻礙了巨噬細胞吞噬其他物質(zhì)。但MWCNT究竟如何影響吞噬，以及是否與細胞骨架有關(guān)，尚需進一步探索。

本項研究的主要技術(shù)手段是流式細胞術(shù)，其優(yōu)勢在于可以精確定量分析。研究結(jié)果提示，MWCNT對巨噬細胞吞噬功能有抑制作用。這一效應(yīng)在今后的納米生物學(xué)、納米毒理學(xué)和納米醫(yī)學(xué)研究方面應(yīng)引起重視。

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