周麗威 孫玉紅 王艷

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是指在動(dòng)植物體外生長(zhǎng)［1］, 并不再形成組織。培養(yǎng)物一般為細(xì)胞群, 也可以是單個(gè)細(xì)胞, 近年來, 其已經(jīng)成為很多生物制品的主要材料, 并廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)病理研究, 本文針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)存在的一些常見問題進(jìn)行分析研究,并提出相應(yīng)防控措施, 現(xiàn)總結(jié)如下。

1 CO2的濃度水平以及培養(yǎng)箱的衛(wèi)生條件

1.1 CO2的濃度水平 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的過程中, 一般CO2的濃度為5%, 對(duì)于特殊細(xì)胞群則取決于培養(yǎng)基中的NaHCO3濃度。

1.2 培養(yǎng)箱的衛(wèi)生條件 CO2培養(yǎng)箱是一個(gè)適宜細(xì)胞群落生長(zhǎng)的模擬環(huán)境［2］, 一般情況下, 其溫度、CO2的濃度、以及酸堿度均較為恒定, 由于體外培養(yǎng)是細(xì)胞失去了生物體提供免疫屏障, 因此, 對(duì)其培養(yǎng)箱內(nèi)的環(huán)境具有一定的敏感性,尤其是培養(yǎng)過程中的污染現(xiàn)象, 會(huì)為其生長(zhǎng)帶來嚴(yán)重影響。因此, 應(yīng)定期清潔培養(yǎng)箱, 更換無菌水盤, 在每次清潔后, 對(duì)培養(yǎng)箱環(huán)境因素的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行檢查, 以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染。

2 細(xì)胞的凍存

2.1 細(xì)胞凍存液的選擇 不同種類的細(xì)胞, 其凍存液的配置也不同, DMSO具有無菌特性, 因此在使用過程中無需高壓滅菌, 反復(fù)冷凍, 進(jìn)而有效降低了細(xì)胞污染的發(fā)生率。融合瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞一般采用90%血清加10%DMSO, 腫瘤細(xì)胞選擇30%小牛血清加10%DMSO, 凍存液放置時(shí)間不宜過久, 最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 凍存濃度及方法 多數(shù)細(xì)胞凍存濃度為1×106cell/ml,有特殊細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、融合瘤細(xì)胞等凍存濃度較高, 最佳凍存濃度為5×106cell/ml, 為防止凍存管熱脹冷縮發(fā)生爆裂,因此凍存液以凍存管容量的3/4為宜。進(jìn)行細(xì)胞凍存時(shí), 應(yīng)確保DMSO、血清以及培養(yǎng)基溫度均處于室溫水平, 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞, 并統(tǒng)計(jì)出數(shù)量, 按細(xì)胞種類配置凍存液, 掌握好濃度, 將細(xì)胞加入凍存液, 然后滴至凍存管, 密封擰緊凍存管。標(biāo)注細(xì)胞種類、凍存的時(shí)間以及操作人員等。逐漸降溫的條件下凍存細(xì)胞, 送至儲(chǔ)存處。

3 細(xì)胞的復(fù)蘇

3.1 細(xì)胞的解凍 在從液氮罐取出細(xì)胞時(shí), 操作者應(yīng)做好防范凍存管爆炸的相關(guān)準(zhǔn)備［3］, 戴上防護(hù)面具和手套, 將其取出后立即投入術(shù)中, 加快其解凍速度, 在解凍的過程中,應(yīng)保證管口適當(dāng)高于水面, 以防細(xì)胞被水體污染。部分細(xì)胞解凍后可直接進(jìn)行培養(yǎng), 一些對(duì)DMSO具有較高敏感性的細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行離心處理, 更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

3.2 血清與培養(yǎng)基 少數(shù)細(xì)胞對(duì)血清以及培養(yǎng)基的要求比較寬泛, 多數(shù)細(xì)胞對(duì)血清以及培養(yǎng)基具有特定要求, 因此,為確保細(xì)胞的活性, 在培養(yǎng)同一種細(xì)胞的過程中應(yīng)盡量避免使用條件不同的培養(yǎng)基和血清。

4 細(xì)胞的污染以及相應(yīng)處理措施

4.1 細(xì)胞污染類型 細(xì)胞污染是其培養(yǎng)過程中較為常見的現(xiàn)象, 操作不當(dāng)、培養(yǎng)器皿未進(jìn)行徹底消毒、培養(yǎng)環(huán)境差以及低無菌觀念等均為導(dǎo)致細(xì)胞污染的重要因素。因此, 提高操作人員的技術(shù)水平、定期消毒培養(yǎng)箱等均為有效減少細(xì)胞污染發(fā)生的有效措施。按污染類型, 細(xì)胞污染包括真菌污染、細(xì)菌污染、病毒污染以及支原體污染。正常情況下, 很多細(xì)胞群被污染后, 會(huì)阻滯生長(zhǎng), 產(chǎn)生變形, 很難處理, 而上述菌種比所培養(yǎng)的細(xì)胞更具活性, 培養(yǎng)環(huán)境也十分有利于污染物生存, 因此, 對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行定期消毒具有重要意義。

4.2 污染細(xì)胞的相應(yīng)處理措施 細(xì)胞污染后, 任何補(bǔ)救措施均不理想, 抗生素對(duì)細(xì)胞傷害較大, 故而, 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞污染,應(yīng)及時(shí)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞行滅菌操作, 然后重新培養(yǎng), 對(duì)不宜丟棄的細(xì)胞可選擇廣譜抗生素抑制細(xì)菌生長(zhǎng), 然后于48 h內(nèi)更換培養(yǎng)液, 但是此過程會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不同程度的損傷, 因此更換營養(yǎng)液時(shí), 應(yīng)當(dāng)適宜增加血清濃度, 促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)。對(duì)于微生物導(dǎo)致的細(xì)胞污染, 應(yīng)滅菌后丟棄, 因?yàn)闅⒕蟾鼡Q培養(yǎng)液會(huì)致使大量細(xì)胞死亡, 失去繼續(xù)培養(yǎng)的意義［4］。

綜上所述, 細(xì)胞培養(yǎng)的操作技術(shù)要求較高, 除此之外,細(xì)胞培養(yǎng)成功的影響因素諸多, 例如培養(yǎng)的溫度、酸堿度以及培養(yǎng)箱內(nèi)的清潔情況等, 因此, 在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí), 相關(guān)操作人員應(yīng)該注意細(xì)節(jié), 遵守?zé)o菌操作原則, 盡量降低人為因素帶來的不良影響, 積極研究探索細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù), 使之滿足臨床研究需求。

［1］ 張秀敏,郭風(fēng),王凈,等.細(xì)胞培養(yǎng)常見問題分析及防控措施.醫(yī)學(xué)信息, 2013,24(12):248-249.

［2］ 劉嵐,陳紹坤,余紅.貼壁細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體污染的幾種救治方案療效比較研究.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2012,24(8):1221-1222.

［3］ 吳文亮,楊新河,章蕾,等.細(xì)胞培養(yǎng)中污染的防控措施.臨床合理用藥, 2011,4(1):64-65.

［4］ 周麗薇.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與防止細(xì)胞污染的方法.醫(yī)學(xué)信息,2012, 23(11):4587-4588.