林坤章 邱建烽 尹志亮 劉朝良 朱保建

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 223096;2.江西省蠶桑茶葉研究所)

昆蟲在適應(yīng)外界環(huán)境的過(guò)程中，已經(jīng)形成一套自身的免疫系統(tǒng)，包括體液免疫和細(xì)胞免疫，而這些免疫反應(yīng)是由模式識(shí)別受體調(diào)節(jié)的先天免疫識(shí)別所引發(fā)的［1～2］。體液免疫系統(tǒng)能產(chǎn)生包括凝集素、抗菌肽等一系列的抗菌多肽［3］。凝集素是一種重要的模式識(shí)別受體，在宿主抵御和識(shí)別外界病原物方面扮演著重要的角色，已成為近幾年來(lái)的研究熱題之一。C－型凝集素(C －type lectins)是一種鈣依賴的糖結(jié)合蛋白，屬于凝集素的重要成員之一，在機(jī)體的免疫防御、控制糖蛋白的生物合成等方面具有重要的功能［4～5］。它們一般含有1 個(gè)或多個(gè)由約130氨基酸殘基組成的糖基識(shí)別域［6］。近幾年來(lái)，一些新的凝集素基因陸續(xù)被報(bào)道，它們具有參與細(xì)菌的識(shí)別與清除、調(diào)節(jié)血液封裝和黑化等多方面的功能也一度成為研究的熱點(diǎn)［7～10］。柞蠶(Antheraea pernyi)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，關(guān)于柞蠶抗病能力和防御系統(tǒng)相關(guān)功能基因的關(guān)系是值得研究的課題。克隆獲得柞蠶凝集素基因?qū)窈笱芯孔跣Q的免疫反應(yīng)機(jī)制，提高柞蠶的抗病能力具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

柞蠶五齡幼蟲由河南農(nóng)業(yè)廳贈(zèng)送;大腸桿菌和Top10 感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室所保存。

RNA 提取試劑盒Total RNA kit、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA 純化回收試劑盒購(gòu)于OMEGA 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First strand cDNA synthesis kit 購(gòu)于全式金公司，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 購(gòu)于BD Clontech 公司，Bam HI 和XhoI 核酸內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase 、pMD19 －T 載體試劑盒購(gòu)于TaKaRa 公司，pET－28a 載體購(gòu)于Promega 公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)核酸和氨基酸序列比對(duì)，用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增柞蠶模式識(shí)別受體Lectin 部分片段的引物為:176F:5’－ CTTCGCCCAGCAACTCCAATA － 3’ 和 176R:5’ － TTGACCCGTCGCCCAACTAAC － 3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為176bp。用于RACE － PCR 的引物RC3:5’－ CTTCGCCCAGCAACTCCAATA－3’和RC5 :5’－ TTGACCCGTCGCCCAACTAAC －3’，根據(jù)擴(kuò)增獲得的上述基因片段設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增ORF 框的引物為:fw:5’－ GGCGGATCC－ ATGTATAAGACATTCTTTTGTG － 3’和 rev:5’－ CGCCTCGAGTCAATAGATATTTGGCGAA－3’(下劃線部分分別為BamHI和XhoI 酶切位點(diǎn))。以上引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 柞蠶總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄

柞蠶五齡幼蟲經(jīng)滅活的大腸桿菌注射12 小時(shí)后按RNA 提取試劑盒Total RNA kit 提取總RNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First strand cDNA synthesis kit 方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，定量檢測(cè)后保存于－20°C 冰箱備用。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增

以上步合成的cDNA 第一鏈為模板進(jìn)行Lectin基因cDNA 的PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為:5 μL 10×Buffer、2 μL 引物176F、2 μL 引物176R、4 μL dNTPmix、1. 5 μL cDNA、0. 5 μL Taq 酶、35 μL ddH2O;PCR 反應(yīng)條件為:預(yù)變性:94 ℃、4min;變性:94 ℃、0.5 min;退火:55 ℃、0. 5 min;延伸:72℃、0.5 min;從第2 步開始30 個(gè)循環(huán);延伸:72 ℃、5 min。

1.2.4 RACE 技術(shù)獲得全長(zhǎng)cDNA 序列

參照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech 公司)的使用說(shuō)明書，將所提取高質(zhì)量的RNA 反轉(zhuǎn)錄成RACE cDNA。利用BD AdvantageTM 2 PCR Enzyme System 和試劑盒中提供的10 ×Universal Primer A Mix (UPM)引物，以及所設(shè)計(jì)的特異引物分別以5’RACE cDNA 和3’RACE cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性:94 ℃、5 min;5 個(gè)循環(huán)(變性:94 ℃、1 min;退火:65 ℃、2min);30 個(gè)循環(huán)(變性:94 ℃、1 min;退火:60 ℃、30 s;延伸:72 ℃、1 min)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 開放閱讀框的序列擴(kuò)增

通過(guò)序列分析比對(duì)和NCBI 上的ORF Finder 確定lectin 的開放閱讀框序列，對(duì)ORF 框進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并引入酶切位點(diǎn)后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性:94 ℃、5 min;30 個(gè)循環(huán)(變性:94 ℃、30 s;退火:58 ℃、30 s;延伸:72 ℃、1 min);總延伸:72℃、5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將大小一致條帶膠回收后連入pMD19 －T 載體中，挑選陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和質(zhì)粒抽提，并送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

從前面構(gòu)建的測(cè)序鑒定正確的Lectin 的T 載體質(zhì)粒上用BamHI 和XhoI 雙酶切，切下目的片段，原核表達(dá)載體pET28a 經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI 和XhoI雙酶切，酶切反應(yīng)體系共50 μL:質(zhì)粒10 μL，10 ×K Buffer 5 μL，BamHI 和XhoI 酶各1 μL，ddH2O 33 μL。37 ℃酶切4h 后產(chǎn)物分別膠回收，然后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并測(cè)濃度，再用T4DNA 連接酶將Lectin 片段連入原核表達(dá)載體pET28a 的BamHI和XhoI 酶切位點(diǎn)間。連接反應(yīng)體系為10 μL:酶切Lectin 5 μL，酶切pET28a 1 μL，10 ×T4 Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，ddH2O 2 μL，4 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E. coli DH5α 中.挑取陽(yáng)性單菌落培養(yǎng)，并用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用BamHI和XhoI 雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定是否有外源片段插入，并送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 凝集素基因部分片段的獲得

以柞蠶幼蟲cDNA 為模板進(jìn)行RT－PCR。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后的結(jié)果如圖1，在分子量約176 bp 左右大小的位置存在一條清晰的條帶，該條帶的大小與實(shí)驗(yàn)預(yù)期的大小相近。

圖1 PCR 擴(kuò)增獲得的Lectin 部分片段泳道1、2 為目的片段;M 為分子量標(biāo)準(zhǔn)

圖2 3’－和5’－RACE PCR 產(chǎn)物的電泳分析

2.2 RACE 技術(shù)獲得基因全長(zhǎng)cDNA

根據(jù)已獲得的Lectin 基因的部分cDNA 序列，使用Primer premier 5.0 設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA 的RACE 引物。以合成的相對(duì)應(yīng)的RACE cDNA 為模板，通用引物進(jìn)行RACE PCR 反應(yīng)。結(jié)果表明，3＇－RACE 和5＇－RACE 分別獲得了分子量大小為825 bp 和368 bp 的片段，分別見圖2(a)和圖2(b)。通過(guò)DNAMAN 軟件進(jìn)行序列拼接，獲得lectin 基因全序列(圖3)。

圖3 柞蠶凝集素全長(zhǎng)cDNA 序列

起始密碼子用方框標(biāo)出，終止密碼子用雙下劃線標(biāo)出。

2.3 開放閱讀框的確定和擴(kuò)增

通過(guò)序列分析比對(duì)和NCBI 上的ORF Finder 確定lectin 的開放閱讀框，對(duì)ORF 框引入酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，方法如前所述，片段與預(yù)期大小一致，如圖4。

圖4 PCR 擴(kuò)增獲得的Lectin 目的片段1 為目的片段;M 為分子量標(biāo)準(zhǔn)

圖5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.4 重組質(zhì)粒PET－28a－Lectin 的構(gòu)建和鑒定

Lectin 基因經(jīng)BamHI 和XhoI 雙酶切克隆入經(jīng)同樣酶切的原核表達(dá)載體pET28a，挑選陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及電泳，方法如前，可見大小約為927 bp的目的條帶，經(jīng)測(cè)序表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖5。將其命名為PET－28a－Lectin。

3 討論

先天免疫系統(tǒng)是脊椎和無(wú)脊椎的第一道免疫防御陣線，其發(fā)生過(guò)程借助于模式識(shí)別受體蛋白來(lái)識(shí)別與結(jié)合病原微生物表面的相關(guān)分子模式［11～14］。因而，通過(guò)模式識(shí)別受體蛋白，昆蟲的先天免疫反應(yīng)能夠識(shí)別和結(jié)合不同的病原微生物，從而達(dá)到抗菌和抑菌的作用。動(dòng)物C－型凝集素通過(guò)結(jié)合包括細(xì)菌、真菌和病毒等病原微生物表面的碳水化合物來(lái)促進(jìn)吞噬、黑化和酶原反應(yīng)等免疫反應(yīng)［15～20］。關(guān)于柞蠶的C 型－凝集素及其先天免疫反應(yīng)系統(tǒng)的研究鮮見報(bào)道，研究柞蠶的C－型凝集素是必要的，本研究運(yùn)用RT －PCR 和RACE 技術(shù)從柞蠶中獲得了C 型－凝集素基因的全長(zhǎng)序列并構(gòu)建了一個(gè)能夠表達(dá)Lectin 蛋白的重組表達(dá)載體，以便為今后研究Lectin 蛋白的功能及參與柞蠶的先天免疫反應(yīng)的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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