劉貫山

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101)

煙草重要基因篇：4. 煙草鈣依賴蛋白激酶基因

劉貫山

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101)

蛋白激酶(protein kinase)又稱蛋白質(zhì)磷酸化酶(protein phosphakinase)，是一類催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶；它能把腺苷三磷酸(ATP)上的 γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基上。鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase, CDPK)存在于植物、藻類及部分原生生物中，特別是在植物體內(nèi)分布廣泛，但在細(xì)菌、真菌、酵母、線蟲和動(dòng)物中尚未發(fā)現(xiàn)。CDPK在植物鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著非常重要的作用。在植物體內(nèi)，除了參與碳氮代謝、離子及水分跨膜運(yùn)輸、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)以外，CDPK 廣泛地參與脅迫應(yīng)答反應(yīng)[1]。

1 煙草鈣依賴蛋白激酶基因家族

在植物中，CDPK 是一個(gè)多基因家族，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中有 34 個(gè)[2]，在水稻(Oryza sativa)中有 31 個(gè)[3]，在絨毛狀煙草(Nicotiana tomentosiformis)中有 25 個(gè)[4-5]，在玉米(Zea mays)中有40 個(gè)[6]，在棉花(Gossypium raimondii)中有 41 個(gè)[7]。在普通煙草(Nicotiana tabacum)中，自從 Yoon 等(1999)[8]克隆了第一個(gè) CDPK 基因(NtCDPK1)以來，已經(jīng)克隆分析了 10 個(gè) CDPK 全長(zhǎng)基因(包括NtCDPK1，NtCDPK2 與 NtCDPK3[9]， NtCPK4[10]，NtCPK5[11]，NtCDPK5、 NtCDPK6 與 NtCDPK7[12]，NtCDPK12[13]以及 NtCDPK15[14-15])。同時(shí)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所已經(jīng)克隆并提交 GenBank 的還有 7個(gè)全長(zhǎng) CDPK 基因，分別是 NtCDPK8(HM989873)、NtCDPK9(HQ141792)、NtCDPK10(HM989874)、NtCDPK11(HQ158609)、NtCDPK13(JN662018)、NtCDPK14(JN662019)及 NtCDPK16(JN662021)。因此，目前在普通煙草中已經(jīng)獲得了 17 個(gè)全長(zhǎng) CDPK 基因。與普通煙草親本之一絨毛狀煙草中的 25 個(gè)CDPK基因相比，推測(cè)在普通煙草中應(yīng)該存在 50個(gè)左右 CDPK 基因。另外，在煙草屬的其他種中也有 CDPK基因克隆的報(bào)道；其中，本賽姆氏煙草(Nicotiana benthamiana)1 個(gè)[9]，漸窄葉煙草(Nicotiana attenuata) 4 個(gè)[16]，藍(lán)茉莉葉煙草(Nicotiana plumbaginifolia)2 個(gè)(AJ699160 和 AJ699161)。

2 煙草鈣依賴蛋白激酶參與脅迫應(yīng)答反應(yīng)

2.1 非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)

在普通煙草中，NtCDPK1、NtCDPK2、NtCDPK3、NtCPK4、NtCDPK12 和 NtCDPK15 參與了不同非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。在葉片中，采用植物激素(ABA、赤霉素和細(xì)胞分裂素)、茉莉酸甲酯、殼聚糖、NaCl處理，NtCDPK1 mRNA 積累增加[8]。采用低滲脅迫處理煙草細(xì)胞，NtCDPK2 與 NtCDPK3 轉(zhuǎn)錄本增加[9]。采用赤霉素和 NaCl 處理后，普通煙草的 NtCPK4 表達(dá)量升高[10]。通過實(shí)時(shí)定量 PCR 證明，普通煙草NtCDPK12 的表達(dá)受高鹽和干旱誘導(dǎo)[13]；NtCDPK15 的表達(dá)受鹽脅迫及 ABA 脅迫誘導(dǎo)，但受干旱脅迫抑制[14-15]。

2.2 生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)

普通煙草的 NtCDPK1、NtCDPK2 和 NtCDPK3 以及漸窄葉煙草的 NaCDPK4 和 NaCDPK5 參與了不同的生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。在葉片中，采用傷害(針刺)與真菌激發(fā)子處理，NtCDPK1 mRNA 積累增加[8]。采用生理小種特異的激發(fā)子(Avr9)處理煙草細(xì)胞，NtCDPK2 與 NtCDPK3 轉(zhuǎn)錄本增加[9]。在漸窄葉煙草NaCDPK4 和 NaCDPK5 沉默植株中，當(dāng)傷害或模擬動(dòng)物取食處理后，茉莉酸積累水平特別高；這表明，NaCDPK4 和 NaCDPK5 可能在茉莉酸生物合成早期起作用[17]。

3 煙草鈣依賴蛋白激酶催化其底物蛋白質(zhì)磷酸化

CDPK 通過催化其底物蛋白質(zhì)磷酸化而參與不同的鈣依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在普通煙草中，NtCDPK1可能催化不同的底物。通過酵母雙雜交系統(tǒng)和免疫共沉淀技術(shù)證明，NtCDPK1 的催化底物之一是 26S 蛋白酶體的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基 NtRpn3，因此 NtCDPK1 可能參與調(diào)節(jié)煙草細(xì)胞分裂、分化和死亡[18]，特別在調(diào)節(jié)煙草根系發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用[19]。NtCDPK1 的另一個(gè)催化底物是轉(zhuǎn)錄因子 REPRESSION OF SHOOT GROWTH(RSG)，通過磷酸化 RSG 的絲氨酸-114，NtCDPK1 可以促進(jìn) 14-3-3 信號(hào)蛋白與 RSG結(jié)合，從而調(diào)節(jié)赤霉素生物合成酶[20-21]。實(shí)驗(yàn)證明，NtCDPK2 是通過磷酸化煙草突觸融合蛋白(syntaxin)而響應(yīng)生理小種特異的 Avr9 的[22]。另外，在響應(yīng)生物或非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中，NtCDPK2 和 NtCDPK3也可以被其上游蛋白激酶磷酸化，這些脅迫誘導(dǎo)的磷酸化位點(diǎn)位于 CDPK 的 N 末端可變區(qū)[23]。利用酵母細(xì)胞融合雜交的方法將含有誘餌載體 pGBKT7-NtCDPK12q 的 Y2H Gold 酵母細(xì)胞與含有 cDNA 文庫的Y187 酵母細(xì)胞進(jìn)行融合雜交，獲得 NtCDPK12 的催化底物為一種 RNase H 家族蛋白(NtPS1)[5]。

4 煙草鈣依賴蛋白激酶的催化特異性

CDPK 單肽鏈從 N 端到 C 端可分為 4 個(gè)功能區(qū)(結(jié)構(gòu)域)，依次為可變區(qū)、催化區(qū)、連接區(qū)和調(diào)控區(qū)[1]；同一植物的不同 CDPK 同系物(isoform)的一級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似。催化區(qū)的同源性很高，在擬南芥 CDPK同系物之間，催化活性位點(diǎn)區(qū)域幾乎具有 100%的一致性；連接區(qū)最為保守；調(diào)控區(qū)雖然保守性差，但它是調(diào)控鈣離子結(jié)合的區(qū)域；因此，不同同系物催化不同底物的特異性應(yīng)該來自于很少有同源性的N端可變區(qū)。在 NtCDPK1 的 N 端可變區(qū)的一個(gè)氨基酸突變(R10A，即第 10 位的精氨酸突變?yōu)楸彼?降低了NtCDPK1 與 RSG 的結(jié)合及 RSG 的磷酸化，雖然激酶活性完好無損，但 NtCDPK1 的功能受到抑制[24]。進(jìn)一步研究表明，除了特異地磷酸化 RSG 外，NtCDPK1 在 RSG 磷酸化后還可以轉(zhuǎn)移 14-3-3 蛋白到 RSG 上，然后 RSG 與 14-3-3 蛋白的復(fù)合物脫離 NtCDPK1[25]。因此，NtCDPK1 具有“腳手架激酶”功能，通過對(duì)同一蛋白的催化與腳手架支撐，提高了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性與有效性。

5 問題與展望

雖然對(duì)煙草的部分 CDPK 基因及蛋白同系物進(jìn)行了分析，特別是對(duì) NtCDPK1 進(jìn)行了深入研究，但是煙草(尤其是普通煙草)的很多 CDPK 還沒有得到分離與鑒定。未來的主要挑戰(zhàn)是描繪出煙草 CDPK家族成員在鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮各自作用以及相互協(xié)調(diào)的一幅完整圖譜。

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