李 靜

(川北醫(yī)學(xué)院組胚教研室，四川 南充 637007)

1型糖尿病(T1DM)又名胰島素依賴(lài)型糖尿病(DM)，是由于胰腺產(chǎn)生胰島素的功能遭到破壞，引起胰島素絕對(duì)缺乏，而引起DM。T1DM發(fā)病率呈增加趨勢(shì)，且患者死亡率和常人相比更高〔1，2〕。近些年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T1DM患者淋巴細(xì)胞的增殖能力有抑制作用，對(duì)機(jī)體具有免疫調(diào)節(jié)作用〔3,4〕；Selmani等〔5〕發(fā)現(xiàn)BMSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要細(xì)胞為CD4+Treg 及CD25+Treg細(xì)胞。本文主要探究不同數(shù)目的BMSCs體外對(duì)T1DM大鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響，期望能為臨床DM的治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 清潔級(jí)SD大鼠12只(雄雌各半，體重200～250 g)，購(gòu)自成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM-LG培養(yǎng)基、植物血凝素(PHA)、胎牛血清(賽默飛生物化學(xué)制品有限公司)；鏈脲佐菌素、絲裂霉素C(美國(guó)Sigma公司)，大鼠淋巴細(xì)胞分離液、噻唑藍(lán)(MTT)溶液、二甲基亞砜(深圳達(dá)科為公司)，血糖測(cè)試儀(強(qiáng)生公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng) 隨機(jī)選取雄鼠和雌鼠各3只，麻醉后將其處死。然后無(wú)菌條件下取其雙側(cè)脛骨和股骨，用生理鹽水清洗后剪開(kāi)骨頭兩端，用含10%胎牛血清、1%鏈霉素與1%青霉素的DMEM/F12混合液體沖洗骨髓腔，收集沖洗的液體，將收集的液體40 ml滴入離心管，在離心機(jī)上1 500 r/min離心10 min后收集沉淀細(xì)胞于塑料培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放于37℃、5%CO2的濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3 d后更換培養(yǎng)液，以后每隔2 d進(jìn)行換液并棄去未貼壁細(xì)胞，傳代3次，留取第3代備用。

1.2.2T1DM大鼠模型的建立、淋巴細(xì)胞的制備 剩余的3只雄鼠和3只雌鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)1 w后，連續(xù)5 d分別在腹腔注射1%的鏈脲佐菌素(50 mg/kg，1次/d)，每周末測(cè)定其尾靜脈空腹血糖，若大鼠的尾靜脈空腹血糖大于16.7 mmol/L，且觀察2 w后血糖無(wú)明顯波動(dòng)，則說(shuō)明T1DM大鼠模型建立。模型建立成功后，將6只大鼠麻醉后處死，分別在無(wú)菌條件下取出大鼠脾臟，用剪刀將脾臟剪碎，將碎片加入分離液中分離淋巴細(xì)胞，放入RPMI-1640培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)上，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀將淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整至1×108個(gè)/ml。

1.2.3BMSCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)分為：A組(1 ml淋巴細(xì)胞)、B組(1 ml淋巴細(xì)胞+100 μl PHA)、C組(1 ml淋巴細(xì)胞+1×106BMSCs+100 μl PHA)、D組(1 ml淋巴細(xì)胞+1×105BMSCs+100 μl PHA)、E組(1 ml淋巴細(xì)胞+1×104BMSCs+100 μl PHA)，每組5孔，分別按照分組濃度將相應(yīng)的淋巴細(xì)胞、BMSCs和PHA滴入孔板中，取樣結(jié)束后將孔板置于37℃，5% CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) 淋巴細(xì)胞增殖能力主要采用MTT比色法檢測(cè)：上述淋巴細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)3 d后，選取五組5孔中的3孔，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，3孔的吸光值平均值即為每組的平均吸光值。

1.2.5淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè) 選取五組5孔中剩余的2孔，吸取上清后置于流式管中離心5 min，后滴入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行細(xì)胞重懸，最后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行一般統(tǒng)計(jì)描述、t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs的一般特征 分離出的SD大鼠脛骨和股骨的BMSCs種植后1～3 d生長(zhǎng)滯留，第4天呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，后生長(zhǎng)較為平穩(wěn)。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察，BMSCs形態(tài)呈梭形，胞體細(xì)長(zhǎng)，胞體形狀較為均一；透射電鏡觀察提示該細(xì)胞胞核較大，以類(lèi)圓形、圓細(xì)胞為主；細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器較少；染色質(zhì)電子密度較低、分布稀疏。

2.2五組淋巴細(xì)胞增殖能力的比較 五組樣本的吸光值由大到小分別為：B組>A組> E組>D組>C組。A組的吸光度低于B組(P<0.05)，說(shuō)明PHA對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用；隨著B(niǎo)MSCs數(shù)目的增加，樣本吸光度逐漸降低(P<0.05)，A、B組的吸光度均高于E、D、C組。

2.3五組淋巴細(xì)胞周期及凋亡 A、B、C、D、E組的淋巴細(xì)胞處于G0/G1期的百分比分別為：98.2%、89.5%、97.2%、97.1%、97.0%，僅B組淋巴細(xì)胞有10.5%處于S期，B組淋巴細(xì)胞相對(duì)其他四組增殖活動(dòng)較為活躍；五組淋巴細(xì)胞凋亡水平從小到大依次為：B組

3 討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的多向分化潛能在細(xì)胞因子替代治療、基因治療、組織工程中及器官移植等方面應(yīng)用極為廣泛〔6，7〕。BMSCs既是間充質(zhì)細(xì)胞的一種，也是骨髓中的一種成體干細(xì)胞〔8〕。BMSCs可誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞，從而可解決DM治療的細(xì)胞來(lái)源和免疫排斥等問(wèn)題，是采用細(xì)胞移植治療DM最理想的來(lái)源〔9～11〕。BMSCs可通過(guò)一些免疫介質(zhì)抑制T1DM患者淋巴細(xì)胞的增殖能力，從而控制炎性反應(yīng)。

PHA是運(yùn)用先進(jìn)的超低溫冷凍技術(shù)從紅蕓豆中提取的一種有絲分裂原，它能夠激活免疫細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞)。張秋堂等〔12〕發(fā)現(xiàn)，PHA刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞24 h，CD3+、CD8+細(xì)胞比例明顯增加，CD3+、CD4+、CD3+、CD56+細(xì)胞比例變化不大，而CD3-、CD56+細(xì)胞比例顯著減少。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了PHA對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。對(duì)BMSCs而言，細(xì)胞主要形態(tài)為梭形，胞體細(xì)長(zhǎng)，胞核較大，細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器較少，染色質(zhì)電子密度較低，分布稀疏。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMSCs的數(shù)目越多，其對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用越強(qiáng)。

細(xì)胞周期包括間期〔G1期、S期與G2期〕和分裂期(前期、中期、后期和末期)。本研究說(shuō)明B組淋巴細(xì)胞增殖活動(dòng)較為活躍；而對(duì)和不同數(shù)目BSMCs一起培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞而言，其淋巴細(xì)胞的凋亡水平高于單純淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的凋亡水平，并且隨著B(niǎo)SMCs的數(shù)目增多，淋巴細(xì)胞的凋亡水平逐漸升高。

綜上，BSMCs對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用，且隨數(shù)目增多，其抑制作用越強(qiáng)。

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