趙疆東，王永春，石 菲，詹 皓，孫喜慶第四軍醫(yī)大學 航空航天醫(yī)學系航空航天生物動力學教研室，陜西西安 7003；空軍航空醫(yī)學研究所，北京 004

現(xiàn)代高性能戰(zhàn)斗機在機動飛行中所產(chǎn)生的正加速度(+Gz)具有G值高、增長率快、持續(xù)時間長并可反復出現(xiàn)等特點，其加速度過載已超出飛行員的生理耐受限度，成為威脅飛行人員生命安全的主要因素[1]。在航空飛行中，+Gz對飛行員機體各個系統(tǒng)均產(chǎn)生不良影響，尤其是對心腦系統(tǒng)的影響最為顯著[2]。研究表明，+Gz暴露可造成大鼠心室肌超微結(jié)構(gòu)損傷，能量代謝紊亂，左心室收縮功能明顯下降并可引起大鼠心室肌細胞凋亡[3-4]。自噬是凋亡之外的第二種程序性細胞死亡方式，在進化中高度保守，從酵母、果蠅到脊椎動物和人都可以找到參與自噬的同源基因[5]。微管相關蛋白輕鏈3(LC3)是自噬反應過程中的標志性蛋白之一[6]。自噬與凋亡之間存在交互影響，且都在細胞存亡方面起重要作用。阻斷凋亡能使細胞從凋亡轉(zhuǎn)到自噬性細胞死亡，過度自噬極度損害大量蛋白和細胞器，導致細胞死亡[7]。以往研究已證實，+Gz暴露可引起大鼠心室肌凋亡蛋白表達的增高，然而，+Gz暴露是否可引起心室肌細胞自噬的激活及其作用尚未見報道[4]。本文采用RT-PCR和Western blot方法，觀察了+Gz暴露后大鼠左心室肌中自噬相關基因LC3的表達變化，旨在為進一步研究自噬在+Gz暴露致心室肌損傷中的作用提供理論依據(jù)。

對象和方法

1 實驗動物及模型建立 健康成年雄性SD大鼠(由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)18只，8周齡，體質(zhì)量(198.0±18.02) g。隨機分為對照組(6只)和+10 Gz 5min暴露組(12只)。暴露組分別于+Gz暴露后6 h和24 h時取大鼠心室肌組織進行檢測。

2 +Gz暴露方法 采用動物離心機進行+Gz暴露。大鼠置于自制的有機玻璃盒中(內(nèi)徑13 cm×4 cm×3 cm)，頭朝向離心機軸心，玻璃盒固定于離心機上。離心機半徑為2 m，由計算機進行加速度程序控制。+Gz組大鼠暴露條件：G值為+10 Gz，增長率為1 G/s，峰值作用時間均為5 min。對照組大鼠置于離心機室，但不受加速度作用。

3 RT-PCR檢測LC3 mRNA的表達 利用Trizol提取試劑盒提取各組大鼠心室肌組織總RNA，并檢測濃度及純度。運用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RT-PCR反應將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行PCR反應檢測mRNA表達，引物序列見表1，反應體系為：94℃，30 s；54℃，50 s；72℃，1 min，共35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。柱形圖中將對照組LC3/GAPDH的比值設為1。

表1 RT-PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences for RT-PCR

4 Western blot檢測LC3 蛋白表達 利用RIPA裂解液提取各組大鼠心室肌組織蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量，常規(guī)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后加入LC3抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜，再加入HRP標記的二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h，最后采用ECL化學發(fā)光法進行發(fā)光，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描目的條帶后分析。以GAPDH作為內(nèi)參照。柱形圖中將對照組(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)/GAPDH的比值設為1。

5 統(tǒng)計學分析 相同條件的實驗均重復3次，采用Graphpad Prism軟件進行結(jié)果分析，根據(jù)RT-PCR和Western blot結(jié)果中各目的條帶及內(nèi)參照的灰度值計算比值。實驗數(shù)據(jù)以-x±s表示，采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析處理，單因素方差分析(One-Way，ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 +Gz暴露后大鼠心室肌組織LC3 mRNA的表達變化 與對照組相比，+10 Gz暴露后6 h大鼠心室肌組織LC3 mRNA的表達顯著增加(P＜0.01)，暴露后24 h其表達量仍顯著增加(P＜0.01)。見圖1。此結(jié)果表明，高+Gz暴露可促使心室肌自噬相關基因LC3 mRNA的表達增加，且暴露后24 h自噬表達仍然顯著。

圖 1 + Gz暴露后大鼠心室肌組織LC3 mRNA的表達Fig. 1 Expression of LC3 m RNA in ventricular muscle tissue sample from rats after exposure to +Gz(a P＜0.01, vs control group)

2 +Gz暴露后大鼠心室肌組織LC3蛋白的表達變化 與對照組相比，+10 Gz暴露后6 h大鼠心室肌組織LC3蛋白的表達顯著增加(P＜0.05)，暴露后24 h其表達量仍顯著增加(P＜0.05)。見圖2。+Gz暴露后LC3蛋白的表達變化與LC3 mRNA的檢測結(jié)果基本一致，表明+Gz暴露可能誘導大鼠心肌自噬的激活。

圖 2 +Gz暴露后大鼠心室肌組織LC3蛋白的表達Fig. 2 Exp ression of LC3 p rotein in ven tricu lar m uscle tissue sample from rats after exposure to +Gz(a P＜0.01, vs control group)

討 論

持續(xù)性+Gz暴露對機體影響廣泛，它對人體的循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等都有著不同程度的損害[8]。孫喜慶等[9]研究發(fā)現(xiàn)，+Gz可使麻醉兔心臟泵血功能顯著降低，且隨著G值的升高，其變化越大。周瑛等[3-4]研究表明，+6 Gz/3 min重復暴露1周可引起大鼠心室肌超微結(jié)構(gòu)輕微改變，表現(xiàn)為心室肌肌絲排列基本整齊，肌漿網(wǎng)輕度擴張，細胞連接擴大，間質(zhì)水腫，微血管擴張；而+10 Gz/3 min重復暴露1周可造成大鼠心室肌超微結(jié)構(gòu)的明顯改變，表現(xiàn)為心室肌細胞水腫，核內(nèi)異染色質(zhì)邊集，肌漿網(wǎng)明顯擴張，線粒體反應性增生，空泡化，閏盤連接完全破壞，并可引起大鼠心肌細胞凋亡。

近年來的研究表明，自噬參與許多心臟疾病的發(fā)生和進展過程，如心室肌肥大、心室肌細胞凋亡、心室肌缺血/再灌注損傷、心室肌細胞重塑、擴張性心肌病等[10-12]。自噬是凋亡之外的第2種程序性細胞死亡方式，在進化中高度保守，它是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。自噬在饑餓、缺氧、細胞內(nèi)應激、激素或生長發(fā)育信號等條件下均可誘導產(chǎn)生[13]。在疾病的不同階段，自噬發(fā)揮著不同的作用，或保護心臟，或促進疾病的發(fā)展，這與自噬發(fā)生的基因調(diào)控機制密切相關[14-15]。

自噬和凋亡均可引起細胞死亡，兩者之間存在交互影響。自噬可通過降解受損蛋白、減弱DNA損傷等途徑抑制凋亡[16]。同時，自噬又能為凋亡小體的形成和吞噬作用提供能量，從而促進凋亡的發(fā)生[17]。本課題組以往研究已發(fā)現(xiàn)+Gz暴露可引起大鼠心室肌細胞凋亡，但+Gz暴露后是否會發(fā)生心室肌自噬及其在心室肌損傷中的作用尚未見任何報道。

本實驗觀察了+Gz暴露后大鼠心室肌自噬相關基因LC3的表達變化，結(jié)果表明，+10 Gz/5 min暴露后6 h大鼠心室肌組織LC3的表達顯著增加，暴露后24 h其表達量仍然顯著增加。結(jié)果提示，高+Gz可能誘導大鼠心室肌自噬的激活。其原因可能與+Gz暴露引起的劇烈血流動力學變化、心臟機械牽張和強烈的應激反應等因素有關。+Gz暴露時，全身血液向下半身轉(zhuǎn)移，心臟和大血管向下移位、變形，并且血液充盈度明顯減少，心室肌收縮力減弱，每搏量減少，心率增快，心臟做功量大大增加，而冠狀動脈供血相對不足，最終引起心輸血量減少，主動脈壓下降，心臟供血不足[18]。然而，有關+Gz引起自噬發(fā)生的機制還有待進一步研究。

總之，本研究表明，+10 Gz/5 min暴露可誘導大鼠心室肌自噬相關基因LC3的高表達，提示高+Gz應激可能誘導了心室肌自噬的激活。有關自噬在+Gz致心臟損傷中的作用尚需深入探索。

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