郭 峰 查占山 錢寶華 （第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院輸血科血液免疫研究室，上海 200433）

體外血液實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新:用系統(tǒng)模式研究紅細(xì)胞多種調(diào)節(jié)功能的進(jìn)展①

郭 峰 查占山 錢寶華 （第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院輸血科血液免疫研究室，上海 200433）

系統(tǒng)血液生物學(xué)有關(guān)理論認(rèn)為血液系統(tǒng)是由分系統(tǒng)和子系統(tǒng)組成。各分系統(tǒng)和子系統(tǒng)生物功能有不同分功，但它們之間還有協(xié)作調(diào)控關(guān)系。紅細(xì)胞血紅蛋白參與氧和CO2呼吸功能調(diào)控，紅細(xì)胞膜有多種受體，如補(bǔ)體受體、趨化因子受體參與補(bǔ)體活化，細(xì)胞因子濃度調(diào)控，紅細(xì)胞胰島素受體參與胰島素和血糖濃度調(diào)控［1-7］。當(dāng)異抗原（如艾滋病毒）進(jìn)入血液后，首先激活補(bǔ)體系統(tǒng)，艾滋病毒顆粒黏附上補(bǔ)體C3b，被紅細(xì)胞CD35分子作用后，降解為C3d和C3dg，將這種艾滋病毒交給B淋巴細(xì)胞CR2分子處理，最終通過(guò)有關(guān)機(jī)制遞交給CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞而發(fā)病。有關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞可釋放NK細(xì)胞增強(qiáng)因子，調(diào)控NK細(xì)胞活性。紅細(xì)胞血紅蛋白參與抗淋巴細(xì)胞代謝中氧化作用，使CD4/CD8比值上調(diào)。紅細(xì)胞數(shù)量巨大，膜受體種類眾多，紅細(xì)胞參與血液免疫反應(yīng)和內(nèi)分泌及生化反應(yīng)等系統(tǒng)血液生物學(xué)功能調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。淋巴細(xì)胞可分泌抗體和各種白細(xì)胞因子參與抗感染和抗腫瘤免疫反應(yīng)，淋巴細(xì)胞膜有多種受體如激素受體參與內(nèi)分泌功能調(diào)控等。血小板可釋放多種凝血因子調(diào)控凝血過(guò)程，血小板模有補(bǔ)體受體參與補(bǔ)體活化調(diào)節(jié)，血小板模有CD55、CD59分子參與T淋巴細(xì)胞活性調(diào)節(jié)［4］。所有血細(xì)胞都參與抗感染和抗腫瘤免疫反應(yīng)，血液系統(tǒng)對(duì)外來(lái)致病原的反應(yīng)是一種系統(tǒng)血液免疫反應(yīng)［1-7］。這需要用系統(tǒng)血液生物學(xué)的理論和系統(tǒng)模式實(shí)驗(yàn)方法學(xué)去研究，才會(huì)有新發(fā)現(xiàn)和理論創(chuàng)新。這方面研究工作有很大進(jìn)展，現(xiàn)將有關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 體外血液系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn)體系形成的基礎(chǔ)

機(jī)體免疫系統(tǒng)不是單一機(jī)制，而是通過(guò)眾多基因，蛋白質(zhì)互相作用的復(fù)雜機(jī)制來(lái)調(diào)控免疫反應(yīng)對(duì)抗感染和疾病的?，F(xiàn)代系統(tǒng)免疫學(xué)首先要建立系統(tǒng)模式，根據(jù)研究目的不同，可在細(xì)胞水平，器官水平和機(jī)體整體水平構(gòu)建系統(tǒng)模式仿真。有的學(xué)者著力于在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系建立哺乳動(dòng)物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)仿真系統(tǒng)模式。我們?cè)隗w外紅細(xì)胞免疫黏附功能實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)枸櫞酸抗凝新鮮血是一種動(dòng)態(tài)的和活的血細(xì)胞懸液，是一種保持內(nèi)在互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)信息的血液生命系統(tǒng)［1，7］，具有 4個(gè)特性:整體性、有序性、動(dòng)態(tài)性和目的性，在37℃溫育30 min或1 h后，可稱其為快速血液培養(yǎng)系統(tǒng)。根據(jù)研究目的不同，測(cè)定相應(yīng)的指標(biāo)，設(shè)定相應(yīng)的公式，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可設(shè)計(jì)成不同研究?jī)?nèi)容的血液系統(tǒng)生物學(xué)的體外系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn)體系，簡(jiǎn)稱為系統(tǒng)模式。這是一種體外血液實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法［1］。

2 體外血液系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn)體系種類與應(yīng)用的發(fā)展

血液系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn)體系向多樣化方向發(fā)展，應(yīng)用范圍在不斷擴(kuò)大。

2.1 抗原激活系統(tǒng)血液固有免疫反應(yīng)系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn)種類與應(yīng)用［1］

2.1.1 抗原（如S180）激活各種血細(xì)胞黏附活性變化的系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn)［1］一定量的癌細(xì)胞懸液加到一定量抗凝新鮮全血試管中，混勻后放37℃溫浴30min后，將反應(yīng)物按常規(guī)程序涂片染色。在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞，白細(xì)胞及血小板都可黏附癌細(xì)胞形成花環(huán)。計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，黏附3個(gè)或以上血細(xì)胞為一朵花環(huán)。黏附紅細(xì)胞的為紅細(xì)胞花環(huán)，黏附白細(xì)胞和血小板的計(jì)數(shù)為其他血細(xì)胞花環(huán)。具體方法可參閱文獻(xiàn)［1］。統(tǒng)計(jì)結(jié)果:紅細(xì)胞花環(huán)率平均值為26.5%，其他血細(xì)胞花環(huán)率平均值為0.9%。兩組花環(huán)率相比差異顯著。這說(shuō)明紅細(xì)胞免疫黏附癌細(xì)胞的能力顯著高于白細(xì)胞和血小板。血液中存在補(bǔ)體固有免疫子系統(tǒng)、紅細(xì)胞固有免疫子系統(tǒng)、粒細(xì)胞固有免疫子系統(tǒng)、淋巴細(xì)胞固有免疫及適應(yīng)免疫子系統(tǒng)。這些子系統(tǒng)都參與對(duì)致病原的免疫黏附過(guò)程。但補(bǔ)體固有免疫子系統(tǒng)和紅細(xì)胞固有免疫子系統(tǒng)起主導(dǎo)作用。血液系統(tǒng)對(duì)外來(lái)抗原（病毒、細(xì)菌、癌細(xì)胞）的識(shí)別、黏附、激活系統(tǒng)血液固有免疫和適應(yīng)免疫反應(yīng)的過(guò)程中，紅細(xì)胞在免疫黏附外來(lái)抗原（如癌細(xì)胞S180）中起主干道作用。紅細(xì)胞在免疫黏附致病原后對(duì)它進(jìn)行改變后，它將致病原遞交給白細(xì)胞（包括粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）固有免疫及適應(yīng)免疫子系統(tǒng)，進(jìn)一步激活白細(xì)胞免疫反應(yīng)，我們的實(shí)驗(yàn)證明是紅細(xì)胞CD35分子對(duì)外來(lái)抗原上補(bǔ)體C3b分子起黏附作用［1］。

2.1.2 抗原激活各種血細(xì)胞膜受體活性變化的系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn)［1］實(shí)驗(yàn)組:一定量抗原（如S180癌細(xì)胞）懸液加到抗凝新鮮全血中，對(duì)照組:一定量生理鹽水（與癌細(xì)胞懸液同體積）加到抗凝新鮮全血。兩組分別混勻后放37℃，60 min后，將各自反應(yīng)物按常規(guī)程序處理后，測(cè)定各種血細(xì)胞CD35分子量的變化，白細(xì)胞CXCR4分子量的變化。發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞CD35分子量平均值28.65%，明顯低于對(duì)照組紅細(xì)胞CD35分子量平均值（40.21%）。說(shuō)明癌細(xì)胞黏附到紅細(xì)胞CD35分子上，使測(cè)定量明顯下降。研究還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞CD35分子平均值（粒細(xì)胞860.4%，淋巴細(xì)胞239.53%）顯著高于對(duì)照組白細(xì)胞 CD35分子平均值（粒細(xì)胞603.63%，淋巴細(xì)胞154.66%）。還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞 CXCR4分子平均值 （粒細(xì)胞64.18%，淋巴細(xì)胞40.16%）顯著高于對(duì)照組白細(xì)胞CXCR4分子平均值 （粒細(xì)胞40.62%，淋巴細(xì)胞34.40%）。這些測(cè)定結(jié)果說(shuō)明在補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)致病原處理后，免疫黏附到紅細(xì)胞CD35分子，紅細(xì)胞CD35等有關(guān)免疫分子處理后將有關(guān)致病原信息傳遞給各種白細(xì)胞，進(jìn)一步激活白細(xì)胞上的CD35分子，CXCR4分子及其他有關(guān)免疫分子，引發(fā)白細(xì)胞進(jìn)一步的固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。這為補(bǔ)體、紅細(xì)胞、白細(xì)胞免疫反應(yīng)為主干道的系統(tǒng)血液固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的系統(tǒng)血液生物學(xué)理論創(chuàng)新打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為免疫調(diào)節(jié)藥（包括疫苗）實(shí)驗(yàn)性治療研究提供了血液系統(tǒng)模式體外實(shí)驗(yàn)方法。我們認(rèn)為對(duì)艾滋病病毒的免疫調(diào)節(jié)藥實(shí)驗(yàn)治療研究也可利用這血液系統(tǒng)模式進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)性治療研究。有關(guān)系統(tǒng)血液固有免疫學(xué)和系統(tǒng)血液生物學(xué)理論，還可查閱有關(guān)文獻(xiàn)［1-8］。

2.2 不加抗原激活系統(tǒng)血液固有免疫反應(yīng)的體外血液系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn)體系的發(fā)展與應(yīng)用［8-18］我們用系統(tǒng)模式研究原發(fā)性肝癌的紅細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子、血糖、血CO2等多種調(diào)節(jié)功能的變化，發(fā)現(xiàn)肝癌患者紅細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子（如IL-8）濃度、血糖濃度、血CO2濃度調(diào)控能力都明顯下降。這種血液系統(tǒng)模式分兩組:全血細(xì)胞培養(yǎng)組:0.2 ml全血細(xì)胞懸液加0.3 ml自身富含血小板血漿和0.2 ml生理鹽水，白細(xì)胞培養(yǎng)組:0.2 ml白細(xì)胞懸液加0.3 ml富含血小板自身新鮮血漿和0.2 m l生理鹽水。各自混勻，37℃溫育60 min后，將反應(yīng)物離心分離，各組反應(yīng)液分別測(cè)定IL-8含量或血糖含量或血CO2含量，設(shè)公式，求出各自調(diào)控率。調(diào)控率=（全血細(xì)胞培養(yǎng)組測(cè)定值如IL-8值或血糖值或血CO2值－白細(xì)胞培養(yǎng)組測(cè)定值如IL-8值或血糖值或血CO2值）/白細(xì)胞培養(yǎng)組測(cè)定值如IL-8值或血糖值或血CO2值。

2.2.1 肝癌患者紅細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子濃度的調(diào)控能力變化的系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn) 肝癌患者血液實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組;正常人血液實(shí)驗(yàn)分全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組。實(shí)驗(yàn)后測(cè)定四組各自IL-8濃度，肝癌患者全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組 IL-8平均值分別是 350.76和424.97，正常人全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組IL-8平均值分別是4.28和14.49。求出正常人和肝癌患者各自紅細(xì)胞對(duì)IL-8吸附率，發(fā)現(xiàn)正常人紅細(xì)胞對(duì)IL-8吸附率 （平均值0.62）明顯高于肝癌紅細(xì)胞對(duì)IL-8吸附率 （平均值0.17），這說(shuō)明肝癌患者紅細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子濃度調(diào)控能力明顯下降。肝癌患者血IL-8含量明顯升高，可出現(xiàn)細(xì)胞因子IL-8風(fēng)暴，與紅細(xì)胞趨化因子受體功能缺陷有關(guān)，具體研究方法可查閱有關(guān)論文［9-13］。

2.2.2 肝癌患者紅細(xì)胞對(duì)血糖濃度的調(diào)控能力變化的系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn)。肝癌患者血液實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組;正常人血液實(shí)驗(yàn)分為全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組。實(shí)驗(yàn)后測(cè)定四組各自血糖濃度，肝癌患者全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組血糖平均值分別是40.44和46.64。正常人全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組血糖平均值分別是41.20和49.17。求出正常人和肝癌患者各自紅細(xì)胞對(duì)血糖調(diào)控率分別是0.161 7和0.133 6，t=2.931 7，P＜0.05，差異顯著。肝癌患者紅細(xì)胞對(duì)血糖調(diào)控率明顯下降。肝癌患者紅細(xì)胞胰島素受體功能缺陷，血糖利用能力下降。原發(fā)性肝癌患者肝臟合成糖原功能受損，糖代謝障礙，血糖濃度下降。癌細(xì)胞增殖需要消費(fèi)大量葡萄糖，癌細(xì)胞分泌胰島素，都使血糖含量明顯下降。所以在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肝癌患者血漿中血糖含量明顯低于正常人血漿中血糖含量。原發(fā)性肝癌患者肝參與造血功能受損，通常都伴有貧血，紅細(xì)胞膜各種受體功能受損，包括紅細(xì)胞胰島素受體功能受損，表現(xiàn)對(duì)胰島素有抗性，所以在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)肝癌患者紅細(xì)胞對(duì)血糖吸附率明顯低于正常人紅細(xì)胞對(duì)血糖吸附率。肝癌患者不僅紅細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能下降，而且紅細(xì)胞胰島素受體功能等其他生物學(xué)調(diào)節(jié)功能下降。具體研究方法可查閱有關(guān)論文［11-13］。

2.2.3 肝癌患者紅細(xì)胞對(duì)血CO2濃度的調(diào)控能力變化的系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn) 肝癌患者血液實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組。正常人血液實(shí)驗(yàn)分全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組。實(shí)驗(yàn)后測(cè)定四組各自血CO2濃度，肝癌患者全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組血CO2平均值分別是13.09和13.63，正常人全血細(xì)胞培養(yǎng)組和白細(xì)胞培養(yǎng)組血CO2平均值分別是11.46和13.76。求出正常人和肝癌患者各自紅細(xì)胞對(duì)血CO2調(diào)控率分別是0.16和0.04，t=23.19，P＜0.01，肝癌患者紅細(xì)胞對(duì)血CO2調(diào)控率明顯下降。肝癌患者血CO2含量明顯上升，與紅細(xì)胞血紅蛋白功能缺陷有關(guān)。肝癌患者不僅紅細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能下降，紅細(xì)胞胰島素受體生物學(xué)調(diào)節(jié)功能下降。而且肝癌患者貧血，血紅蛋白功能受損，帶走CO2能力下降，表現(xiàn)為紅細(xì)胞對(duì)血CO2調(diào)控率明顯低下。肝癌患者貧血引發(fā)紅細(xì)胞的系統(tǒng)血液生物學(xué)調(diào)節(jié)功能全面處于紊亂與不平衡。我們研究說(shuō)明新鮮血快速培養(yǎng)系統(tǒng)可設(shè)計(jì)為系統(tǒng)血液生物學(xué)（包括系統(tǒng)血液免疫學(xué)）體外實(shí)驗(yàn)體系，用于紅細(xì)胞各種系統(tǒng)生物學(xué)調(diào)節(jié)功能研究是可行的，不僅可用于紅細(xì)胞各種天然免疫調(diào)節(jié)功能研究，而且也可用于激素，血CO2調(diào)控等紅細(xì)胞的其他系統(tǒng)生物學(xué)調(diào)節(jié)功能研究。我們還認(rèn)為可設(shè)計(jì)為白細(xì)胞，血小板各種系統(tǒng)血液生物學(xué)調(diào)節(jié)功能研究也是可行的［7-19］。

3 展望與小結(jié)

枸櫞酸抗凝新鮮血是一種動(dòng)態(tài)的和活的血細(xì)胞懸液，而枸櫞酸抗凝新鮮血細(xì)胞快速培養(yǎng)系統(tǒng)可設(shè)計(jì)為紅細(xì)胞的各種血液生物學(xué)（包括免疫和生化等）調(diào)控系統(tǒng)模式仿真實(shí)驗(yàn)體系，這是一種系統(tǒng)生物學(xué)研究方法。利用系統(tǒng)模式研究可發(fā)現(xiàn)血漿、紅細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞之間動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。這種發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)免疫學(xué)和系統(tǒng)血液生物學(xué)研究中具有重要理論和應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步優(yōu)化各種免疫和生化指標(biāo)，合理設(shè)計(jì)仿真血液系統(tǒng)模式實(shí)驗(yàn)體系，能形成具有我國(guó)特色的一種系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，為我國(guó)醫(yī)藥（包括中醫(yī)藥）等相關(guān)基礎(chǔ)理論創(chuàng)新研究服務(wù)［7-19］。

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［收稿2013-05-10 修回2013-06-13］

（編輯 張曉舟）

R392.33

A

1000-484X（2014）05-0705-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.031

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30671940）。

郭 峰（1939年－）男，研究員，碩士生導(dǎo)師，國(guó)務(wù)院政府特殊津貼獲得醫(yī)學(xué)專家，中國(guó)免疫學(xué)會(huì)血液免疫分會(huì)紅細(xì)胞免疫學(xué)組顧問(wèn)，主要從事紅細(xì)胞免疫學(xué)和血液免疫學(xué)研究，E-mail:guof@hotmail.com。