李澤鴻，付玉和，劉 瑩，史 飛，劉玉華

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春130118;2.哈爾濱工程大學(xué)醫(yī)院，哈爾濱150021)

白喉毒素(DT)是白喉?xiàng)U菌產(chǎn)生的細(xì)菌外毒素，是一個(gè)由535個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量約為62 kDa［1］。有三個(gè)不同功能區(qū):N端為催化區(qū)，中間為穿膜區(qū)，C端為受體結(jié)合區(qū)，其中催化區(qū)為毒素發(fā)生毒性作用的部位，是白喉毒素的酶活性區(qū)，它通過阻止延長因子-2在核糖體內(nèi)促進(jìn)多肽鏈延長而抑制蛋白質(zhì)合成造成細(xì)胞死亡，具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性。這類毒素的毒性很強(qiáng)，能損害哺乳動(dòng)物的大多數(shù)器官，如心臟、肝臟、肺和腎臟［2］。人類、猴、家兔、豚鼠以及家禽等的組織細(xì)胞對白喉毒素均敏感，而小白鼠、大鼠的組織細(xì)胞對毒素不敏感。鑒于其對細(xì)胞的巨大殺傷作用，近年來白喉毒素被廣泛用于腫瘤的基因治療以及疾病動(dòng)物模型的建立，白喉毒素就被用在小鼠和人類的抗癌上，而且將它的突變體用于免疫和抗炎，如CRM197雖然沒有白喉毒素的活性，但它含有免疫作用［3］。

免疫毒素(immunotoxins，ITs)的概念源于1906年德國藥物化學(xué)家Erhlich提出的靶向治療，免疫毒素是由腫瘤特異性的基團(tuán)(如抗體生長因子或者是肽)與修飾的毒素組成的嵌合蛋白，這些分子與細(xì)胞表面受體結(jié)合，然后通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。蛋白質(zhì)工程和噬菌體展示技術(shù)的進(jìn)步使得更高親和性的靶向部位的選擇成為可能［4］。因此，在構(gòu)建免疫毒素時(shí)，既要尋找具有細(xì)胞選擇性的定向“載體”，又要篩選高效的毒素“彈頭”。近年來也有研究表明不與腫瘤特異性基團(tuán)結(jié)合的重組白喉毒素也對腫瘤細(xì)胞具有殺滅作用［5］。由于白喉毒素類免疫毒素能高效、特異地殺傷特定靶細(xì)胞，從而使其在腫瘤等疾病的藥物開發(fā)中暫露頭角，1999年美國FDA批準(zhǔn)一種基于白喉毒素的免疫毒素ONTAK上市，用于治療成人皮膚細(xì)胞淋巴瘤，因而推動(dòng)了一批白喉毒素類免疫毒素的開發(fā)與臨床研究［5］。隨后的研究表明其在其他一些腫瘤以及一些自身免疫病、免疫排斥方面等也有作用［6］。

1 重組免疫蛋白或者免疫偶聯(lián)物的構(gòu)建

選擇性免疫毒素的原則在于腫瘤細(xì)胞通常具有極少或特定的生長因子，受體或抗原在細(xì)胞表面高度表達(dá)，與這些分子一致的配體與修飾毒素結(jié)合(通過修飾來減少它本來的功能)［7］，近幾年使用被截?cái)嗟娜狈κ荏w結(jié)合域的白喉毒素來構(gòu)建重組免疫毒素是獲得有效毒素的最佳方案之一，這種單鏈構(gòu)造物具有低分子量，更容易轉(zhuǎn)移進(jìn)入組織，低毒性等一系列優(yōu)點(diǎn)［8］。

1.1 短肽與白喉毒素的重組構(gòu)建 基于肽的治療已經(jīng)成為在癌癥靶向治療的最有前途的治療策略之一，抗體基礎(chǔ)上的免疫偶聯(lián)物是以能傳遞細(xì)胞毒素到達(dá)靶點(diǎn)的單克隆抗體為靶向目標(biāo)。利用PCR技術(shù)構(gòu)建短肽與白喉毒素的重組原核表達(dá)載體，并進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)及鑒定，從而為進(jìn)一步研究導(dǎo)向肽對惡性腫瘤的靶向性治療奠定了基礎(chǔ)［9］。如DT390-triTMTP1能通過選擇性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制癌細(xì)胞增殖來控制癌癥的病情［10］。細(xì)胞毒素劑可以是強(qiáng)效藥物、放射性同位素、毒素等，這些分子稱為抗體藥物，偶聯(lián)在白喉毒素基礎(chǔ)上構(gòu)建的免疫毒素與抗體結(jié)合構(gòu)建免疫偶聯(lián)物是癌癥治療的一種可能的途徑［11］，如白喉毒素和豬細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CD152)構(gòu)建的重組融合蛋白，通過構(gòu)建可溶的N-端糖基化和N-端非糖基化的豬CTLA-4經(jīng)過小鼠病理實(shí)驗(yàn)選擇出最具親和力的免疫蛋白用于移植耐受、自身免疫病和癌癥治療［12］。以及二價(jià)的抗人的CD3免疫毒素重組體的分子修飾導(dǎo)致小鼠體內(nèi)毒副反應(yīng)減少［13］，雙特異的配合基定向毒素(DT2219ARL)靶向作用于人類CD19和CD22感受器導(dǎo)致系統(tǒng)B細(xì)胞腫瘤的治療功效提高［14］。

1.2 與細(xì)胞因子重組的功效 與細(xì)胞因子的重組構(gòu)建相匹配，機(jī)體的各種細(xì)胞均能合成和分泌小分子的多肽類因子，它們調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能，參與各種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡并行使功能，這些因子稱為細(xì)胞因子。根據(jù)細(xì)胞因子的功能可將其分為干擾素(IFN)集落刺激因子(CSF)、白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子、DT轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF2β)及生長因子等6類［15］，繼ONTAK 之后各國科學(xué)家對白喉毒素與細(xì)胞因子的重組蛋白進(jìn)行了很多的研究，如DTIL3K116W(白喉毒素與白介素3的融合蛋白)已進(jìn)行了一期臨床研究［16］，以白喉毒素為基礎(chǔ)與豬白細(xì)胞介素2重組融合蛋白來減少豬的CD25+細(xì)胞的研究已證明了其穩(wěn)定性［17］，靶向作用于白血病細(xì)胞系的白細(xì)胞介素2受體的經(jīng)過修飾的IL2融合毒素蛋白的構(gòu)建，以及在ONTAK基礎(chǔ)上構(gòu)建的4個(gè)融合蛋白SPRSV1、SPRSV2、SPRSV3、SPRSV4，然后通過各種細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其對白血病細(xì)胞系的毒性大小得出最佳選擇［18］，發(fā)現(xiàn)DT388-粒細(xì)胞集落刺激生物因子融合蛋白用于骨髓白血病［19］，DAB389IL-2抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫炎癥同時(shí)抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)靶向細(xì)胞［20］，重組細(xì)胞免疫毒素蛋白DT390-IP-10在體內(nèi)控制質(zhì)粒DNA編碼弱化實(shí)驗(yàn)性自身免疫［21］等。

2 免疫毒素的純化和篩選

2.1 白喉毒素的毒性 白喉毒素本身毒性過大，不能直接作為抗原使用，研究發(fā)現(xiàn)通過聚合物甲氧基聚乙二醇激活利用共軛親和層析純化DT和DT解毒的替代方法，從純化的毒素所獲得的類毒素維持其免疫原性的特點(diǎn)［22］。很多重組的治療蛋白已經(jīng)通過大腸桿菌被純化，因?yàn)榇竽c桿菌中的表達(dá)容易獲得，同時(shí)一些不利因素，如蛋白質(zhì)聚集，形成內(nèi)涵體，蛋白被脂多糖污染等均可以適當(dāng)解決［23］。

2.2 白喉毒素的重組活性區(qū)域 用多重蛋白酶缺陷株BH460可表達(dá)出一個(gè)N端254個(gè)氨基酸炭疽致死因子和N端389個(gè)氨基酸的白喉毒素DT389和人類細(xì)胞轉(zhuǎn)變生長因子α(TGFa)的融合蛋白，這個(gè)融合蛋白能夠結(jié)構(gòu)性表達(dá)，并成功在培養(yǎng)的炭疽桿菌上清液中成功分泌，通過離子交換層析和溶蛋白酶裂解從目標(biāo)融合蛋白(DT389-TGFa)中除去 LFn［24］。

2.3 重組蛋白的純化 為了獲得有較高生物活性的靶向重組毒素DT389-IL13，在大腸桿菌中高效表達(dá)DT389-IL13，并采用凝膠過濾的方法對DT389-IL13進(jìn)行柱上復(fù)性及初步純化，然后使用離子交換色譜方法進(jìn)一步純化［25］。

2.4 重組白喉毒素的篩選 人類基因組計(jì)劃的開展和組合化學(xué)庫技術(shù)的發(fā)展，使用高通量篩選，成為各制藥企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)搶占市場、加快藥物研發(fā)步伐的首選［26］。定量的高通量篩選測量細(xì)胞內(nèi)吞作用和ab內(nèi)酰胺酶致死因，為避免致死的炭疽毒素和白喉毒素可利用阻礙炭疽毒素內(nèi)化的小分子的識(shí)別一些小分子保護(hù)RAW264.7巨噬細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞［27］。

3 臨床應(yīng)用

3.1 重組白喉毒素的活性實(shí)驗(yàn) 重組白喉毒素的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道多、療效好、可使荷瘤小鼠完全治愈，副作用低，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明DT/GM-CSF可抑制裸鼠體內(nèi)移植性AML細(xì)胞的生長［28］。荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，重組毒素的療效與使用方法有關(guān)，隔2 d注射共5次最為有效。在SCID鼠、大鼠、猴上均有效［29］，而且局部應(yīng)用重組毒素療效優(yōu)于全身應(yīng)用［30］。應(yīng)用含有白喉毒素A片段(DTA)融合脂質(zhì)體對肉瘤(S-180)細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)、體外殺傷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ddy鼠實(shí)驗(yàn)組比對照組多存活60 d［31］。對于用裸鼠建立的乳腺癌MCF-7細(xì)胞移植瘤模型應(yīng)用瘤內(nèi)注射法給予重組質(zhì)粒PGL3-DF3-DTA治療，治療結(jié)果表明重組質(zhì)粒PGL3-DF3-DAT可以明顯減少腫瘤體積，抑瘤率為50.08%［32］，DT390-biTMTpl融合蛋白通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死，發(fā)揮抑制裸鼠皮下瘤的生長作用［33］。

3.2 白喉毒素的免疫實(shí)驗(yàn) 白喉毒素能夠和細(xì)菌鞭毛蛋白共同刺激IL-17生產(chǎn)胸腺細(xì)胞，作為免疫細(xì)胞群對微生物組件做出快速反應(yīng)［28］;白喉毒素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答應(yīng)用于對胃腸道細(xì)菌感染研究的CD11c-DTRtg模型中［19］;能損害哺乳動(dòng)物的大多數(shù)器官，如心臟、肝臟、肺和腎臟。具有生化和生物學(xué)特性的交叉反應(yīng)的材料197(CRM197)與白喉毒素的無毒突變體的偶聯(lián)蛋白可以作為疫苗或其他潛在的臨床應(yīng)用［34］。

3.3 腫瘤的靶向治療 腫瘤靶向蛋白是由毒素酶制劑與能與癌癥相關(guān)抗原結(jié)合的細(xì)胞特定結(jié)合域結(jié)合形成的，靶向毒素的抗腫瘤治療有其天然副作用，靶向治療應(yīng)用于人類的前景取決于其副作用的減少，一些植物次級(jí)代謝產(chǎn)物(皂苷)被證明能增加表皮生長因子受體為靶向毒素的功效，并且在很大程度上減少副作用［35］。

3.4 白喉毒素對動(dòng)物的藥用研究 以白喉毒素為基礎(chǔ)的免疫毒素與很多臨床的應(yīng)用相關(guān)，猴、家兔、豚鼠以及家禽等的組織細(xì)胞對白喉毒素均敏感，因此白喉毒素作為殺害鼠類的藥物具有一定空間［21］。如自身免疫疾病的治療和器官移植耐受性，已存在的抗白喉毒素抗體，要求在接種抗白喉毒素或者被白喉?xiàng)U菌感染后，能干涉或者抑制這些抗免疫毒素的功能［5］。

3.5 白喉毒素對動(dòng)物的細(xì)胞研究 以白喉毒素為基礎(chǔ)的免疫毒素常用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤、白血病惡性腦瘤、肝癌等［36］，白喉毒素對許多動(dòng)物的致死率極高，如家兔、豚鼠及靈長類。將這些致死劑量換算到人類大約是0.1 μg/kg 體重［16］，如 DAB389IL-2能通過顯著降低脊髓病變細(xì)胞內(nèi)的CD4+，CD8+，CD25+，TCRγδ+表型和 CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量［37］，來抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎［38］;389-hIL13-13E13K(白介素13和白喉毒素的融合蛋白)能靶向地殺滅肝癌細(xì)胞，為肝癌治療提供一個(gè)新的策略或者一個(gè)可供選擇的方案［39］。

3.6 重組白喉毒素的臨床研究 除了已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)的 ONTAK(DAB389-IL-2)外［7］，還有一系列的白喉毒素類免疫毒素已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段:應(yīng)用于急性髓系白血病的DT388-GM-CSF進(jìn)入Ⅰ期臨床等［40］。如應(yīng)用于上皮癌的DAB389-TGF-α已進(jìn)入Ⅲ期臨床，應(yīng)用于骨髓瘤細(xì)胞的DAB390-IL-6進(jìn)入Ⅲ期臨床［41］;用于乳腺癌的DAB389-EGF應(yīng)用于Ⅱ期臨床［41］。

由于重組毒素的活性都要通過動(dòng)物體體現(xiàn)功效，而且實(shí)驗(yàn)表明每一種重組毒素都會(huì)產(chǎn)生一定的特異性活性，可見重組白喉毒素由于具有高特異性、高細(xì)胞毒活性，無疑是動(dòng)物腫瘤和人類治療的主要方面。雖然目前上市的重組白喉毒素類只有ONTAK(DAB389-IL2)，應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)與知識(shí)尚不夠豐富，但是針對各種細(xì)胞表面特征分子的相關(guān)免疫毒素的研究報(bào)道層出不窮，一些免疫毒素在臨床試驗(yàn)的Ⅰ、Ⅱ期顯示了對化療耐藥性和難治愈癌癥的明顯抗癌活性。

4 小結(jié)與展望

由于重組白喉毒素類是通過細(xì)胞表面受體內(nèi)化到靶細(xì)胞上的，因此腫瘤細(xì)胞表面受體的高度表達(dá)是免疫毒素具有較高抗腫瘤活性的關(guān)鍵，應(yīng)考慮到如何選擇最恰當(dāng)?shù)姆椒ㄟB接靶向部分和毒性部分。連接方法的恰當(dāng)與否直接關(guān)系著白喉類重組免疫毒素的穩(wěn)定性、靶向能力和毒性效力?？衫貌煌膶?dǎo)向因子，不同的連接方法連接到白喉毒素，構(gòu)建不同的重組白喉毒素，達(dá)到治療不同疾病的功效，實(shí)現(xiàn)重組毒素特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，減少白喉毒素的免疫原性，達(dá)到降低或消除其副作用的目的。另外通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面靶點(diǎn)的表達(dá)促進(jìn)白喉毒素類免疫毒素的作用，尋找靶細(xì)胞上特異的靶點(diǎn)，包括對決定載體及毒素分子免疫原性的部位進(jìn)行定位突變或基因刪除等修飾，選擇小分子量的毒素，開發(fā)人源化的載體選擇恰當(dāng)?shù)倪B接子以提高載體和毒素分子的穩(wěn)定性。

綜上所述，開發(fā)親和力強(qiáng)而細(xì)胞內(nèi)毒副反應(yīng)弱的融合蛋白是重組白喉毒素構(gòu)建和臨床應(yīng)用的重要方向。而且重組白喉毒素也可以在治療動(dòng)物的免疫疾病和腫瘤盡顯功效。盡管白喉毒素類免疫毒素靶向治療腫瘤尚存在一些問題，但隨著蛋白質(zhì)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組白喉毒素類免疫毒素將有望成為治療惡性腫瘤的有效手段。相信具有高效、特異性強(qiáng)的白喉毒素類藥物在癌癥治療的臨床應(yīng)用上將有著更大的發(fā)展空間和更廣闊的應(yīng)用前景。

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