劉永香

（四川省雅安市雨城區(qū)八步鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，四川雅安 625000）

長(zhǎng)期以來(lái)，動(dòng)物傳染病不僅給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)，也直接威脅到人類自身的生存和發(fā)展。鑒于人類健康與動(dòng)物聯(lián)系日益緊密的現(xiàn)狀，雨城區(qū)采取注射疫苗的方法預(yù)防和控制重大動(dòng)物疫病。而疫苗在動(dòng)物機(jī)體中產(chǎn)生抗體的效果直接影響到重大動(dòng)物疫病的控制、發(fā)生和發(fā)展，做好抗體水平監(jiān)測(cè)利于制定科學(xué)的免疫程序、評(píng)價(jià)疫苗的質(zhì)量、預(yù)警重大動(dòng)物疫病等。

1 基層獸醫(yī)站技術(shù)條件現(xiàn)狀分析

1.1 部分基層獸醫(yī)站辦公條件差

實(shí)驗(yàn)室軟件和硬件儀器設(shè)備不到位，有些僅有一些最基本的設(shè)備設(shè)施，如防疫包、手術(shù)剪刀、夾鑷子、燒杯、燒瓶、離心機(jī)等，有些地方甚至沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室。每次做抗體檢測(cè)都要送到區(qū)、市或省實(shí)驗(yàn)室。這樣，不僅樣品采集、運(yùn)輸、保存耽誤很多時(shí)間，耗費(fèi)人力，并且需要加大經(jīng)費(fèi)的投入。

1.2 專業(yè)知識(shí)有待提高

由于基層獸醫(yī)站的技術(shù)人員部分來(lái)自鄉(xiāng)村獸醫(yī)，未經(jīng)過(guò)專業(yè)理論學(xué)習(xí)，對(duì)于開(kāi)展抗體檢測(cè)的知識(shí)缺乏。

1.3 只用購(gòu)買的金標(biāo)試紙條，成本較高

2 實(shí)驗(yàn)室凝集試驗(yàn)

2.1 血凝試驗(yàn)和血凝抑制實(shí)驗(yàn)

凡具有血凝特性的病毒均可選用，如，新城疫病毒、禽流感病毒、禽傳支病毒等。

2.1.1 目的

通過(guò)滴定病毒的血凝效價(jià)，可用于監(jiān)測(cè)血清中抗體水平，也可用于判斷未使用疫苗群體的感染狀態(tài)等。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)器材及試劑

待檢病毒（可購(gòu)買）、待檢血清、生理鹽水、1%雞紅細(xì)胞懸液、96孔V形微量血凝板、加樣器、離心機(jī)等。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

（1）血凝試驗(yàn)（HA）：取96孔V形血凝板，按以下步驟操作：

第1步：第1排1～12孔各加生理鹽水50μl；

第2步：吸50μl病毒液于第1排第1孔，混勻后取50μl至第2孔，依次稀釋至第12孔，棄去50μl；

第3步：第1排1～12孔加1%雞紅細(xì)胞懸液50μl，微型震蕩器震蕩2 min（如沒(méi)有可用手輕拍）混勻；

第4步：37 ℃溫箱靜置30 min；

第5步：判定結(jié)果，將血凝板傾斜45°，看是否呈淚滴狀，不呈淚滴狀的說(shuō)明發(fā)生血凝。以4單位抗原進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)。

（2）血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）：配置4單位抗原，取96孔血凝板，按以下步驟操作：

第1步：第1排1～12孔各加生理鹽水50μl；

第2步：吸50μl病毒液于第1排第1孔，混勻后取50μl至第2孔，依次稀釋至第10孔，棄去50μl；11孔加陽(yáng)性對(duì)照血清；12孔加陰性對(duì)照血清；

第3步：第1排1～12孔各加4單位抗原50μl；

第4步：第1排1～12孔加1%雞紅細(xì)胞懸液50μl，微型震蕩器震蕩2min（如沒(méi)有可用手輕拍）混勻。

第5步：37 ℃溫箱靜置20 min；

第6步：判定結(jié)果，將血凝板傾斜45°，以孔底沉淀的紅細(xì)胞流動(dòng)性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無(wú)凝集顆粒為凝集完全抑制。以此判定免疫動(dòng)物的抗體水平。

2.2 牛布魯氏菌虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)

豬牛羊檢測(cè)皆可采用此法。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

用布魯氏菌緩沖抗原診斷布魯氏菌病的一種簡(jiǎn)便方法。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)器材及試劑

被檢血清、玻璃平板、布病虎紅抗原（購(gòu)買）、標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清（購(gòu)買）、吸管或分裝器。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

第1步：將玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號(hào)，然后加相應(yīng)的血清30μl；

第2步：在每孔滴加抗原30μl；

第3步：設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照；

第4步：用牙簽類小棒攪動(dòng)血清和抗原使之混合，室溫（20 ℃）5～10 min內(nèi)記錄反應(yīng)結(jié)果；

第5步：判定結(jié)果：在陰陽(yáng)性血清對(duì)照成立的條件下，方可對(duì)被檢血清進(jìn)行判定。受檢血清在4 min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集現(xiàn)象者判為陽(yáng)性（+），無(wú)凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（-）。

2.3 間接血凝實(shí)驗(yàn)

豬瘟、口蹄疫檢測(cè)均可采用此法。

2.3.1 目的

對(duì)動(dòng)物疫病的早期診斷以及測(cè)定免疫動(dòng)物血清抗體效價(jià)。

2.3.2 器材及試劑

被檢血清、6孔微量血凝板、微量移液器、間接血凝抗原（購(gòu)買）、陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清（購(gòu)買）、稀釋液。

2.3.3 實(shí)驗(yàn)方法

第1步：診斷前，將間接血凝抗原加稀釋液浸泡7～10 d前；將待檢血清在56 ℃水浴鍋滅活30 min；

第2步：第1排1～6孔各加稀釋液50μl；

第3步：吸50μl被檢血清于第1排第1孔，混勻后取50μl至第2孔，依次稀釋至第6孔，棄去50μl；

第4步：設(shè)陰性和陽(yáng)性地照血清；

第5步：第1排1～6孔各加血凝抗原25μl震蕩混勻。將血凝板置于微量振蕩器1～2 min，（如無(wú)振蕩器，用手輕拍混勻亦可）。室溫或37 ℃下靜置1.5～2.0 h后判定結(jié)果；

第6步：判定結(jié)果：先觀察陰性血清對(duì)照和稀釋液對(duì)照孔，紅血球應(yīng)全部沉入孔底，無(wú)凝集現(xiàn)象（－）或呈陽(yáng)性（+）的輕度凝集為合格；陽(yáng)性血清對(duì)照應(yīng)呈（+++）凝集為合格。

在以上3孔對(duì)照合格的情況下，觀察待檢血清各孔的凝集程度，以呈“++”凝集的待檢血清最大稀釋度為血凝效價(jià)（血凝價(jià)）。血清的血凝價(jià)一般以達(dá)到1∶16為免疫合格。

3 酶聯(lián)免吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

可用于豬細(xì)小病毒、豬藍(lán)耳病、豬乙型腦炎、偽狂犬、豬瘟、口蹄疫等抗體檢測(cè)。

3.1 目的

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試驗(yàn)具有靈敏性、特異性高，且重復(fù)性好，檢測(cè)速度快的特點(diǎn)，尤其適合于大批量血清樣品的檢測(cè)，是國(guó)際認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)化診斷方法。

3.2 器材及試劑

被檢血清、多孔移液器及一次性槍頭、國(guó)標(biāo)試劑盒（購(gòu)買）、酶標(biāo)儀、EP管、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫箱等。

3.3 方法

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，具體步驟如下：

第1步：樣本稀釋：用樣本稀釋液將待檢血清按比例稀釋，充分混勻；陰性對(duì)照血清、陽(yáng)性對(duì)照血清不用稀釋，直接加樣。

第2步：加樣反應(yīng)：取出所需反應(yīng)板條，樣本檢測(cè)孔每孔分別加已稀釋樣本血清 50μl。同時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照各1孔，取陰性、陽(yáng)性對(duì)照各50μl分別加入反應(yīng)孔內(nèi)，空白對(duì)照孔僅加入25μl樣本稀釋液。

第3步：37 ℃避光反應(yīng)30 min后甩去孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液1滴，立即用蒸餾水注滿，靜置30 s后甩去，再直接用蒸餾水洗滌4次，每次均靜置30 s后甩去，最后1次甩去拍干。

第4步：加酶反應(yīng)：除空白對(duì)照孔外其余每孔加酶結(jié)合物2滴，37 ℃避光反應(yīng)30 min后甩去孔內(nèi)液體，如上洗滌，拍干。

第5步：顯色反應(yīng)：加底物 和顯色劑各1滴，混勻，37 ℃下避光顯色10 min。

第6步：加終止液1滴，混勻，終止反應(yīng)（加終止液后藍(lán)色會(huì)變?yōu)辄S色）。

第7步：結(jié)果判定：

肉眼觀察：陰性對(duì)照接近無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照呈明顯黃色，表示試驗(yàn)有效。待檢孔接近無(wú)色表示該標(biāo)本為陰性，待檢孔呈明顯黃色表示該標(biāo)本為陽(yáng)性。

儀器判斷：以空白對(duì)照調(diào)零用酶標(biāo)儀于 450 nm（620 nm作參比波長(zhǎng)）讀取OD值，待檢孔OD值大于陰性2.1倍者為陽(yáng)性。當(dāng)陰性對(duì)照OD值低于0.05時(shí)按0.05計(jì)算。

4 注意事項(xiàng)

以上樣品量是舉例說(shuō)明，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒和操作規(guī)程進(jìn)行。