常耀祖 楊永春 施進文

（寧夏同心縣動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏吳忠 751300）

近年來，高致病性禽流感疫情在世界各地均有發(fā)生，人感染高致病性禽流感的事件越來越多。預(yù)防高致病性禽流感已成為全球性的大事。防制高致病性禽流感的主要措施是對禽鳥進行禽流感疫苗的預(yù)防接種，同時，提倡有效免疫，要求免疫的禽只體內(nèi)產(chǎn)生足夠高的抗體，以抵御禽流感病毒的侵襲。為此，我國各地的動物防疫監(jiān)督機構(gòu)需要對禽鳥進行定期的禽流感疫苗抗體水平的監(jiān)測。

對禽流感抗體水平的監(jiān)測一般采用血凝試驗和血凝抑制試驗（HA-HI試驗），其技術(shù)規(guī)范依照GB/T18936-2003進行。該試驗方法具有經(jīng)濟、操作簡便和對抗體水平進行量化的優(yōu)點，已在各地動物防疫監(jiān)督機構(gòu)和養(yǎng)殖場廣泛使用。

1 樣品的保存

（1）采集的血液樣品應(yīng)及時分離血清，最好分裝至離心管中，標(biāo)記清楚，離心后吸出血清，對應(yīng)編號冷藏送檢，并禁止運輸過程中劇烈震動。

（2）一般情況下，在5 d內(nèi)檢測的樣品可放置在4 ℃的冰箱中冷藏，否則，低溫冷凍保存。

（3）在檢測前血清樣品應(yīng)充分混勻，混勻時采用上下緩慢顛倒幾次的方法即可，切忌劇烈振蕩，引起產(chǎn)生氣泡及血清中蛋白變性。

（4）對出現(xiàn)膠胨狀的血清樣品，可采用反復(fù)攪動幾下，再離心的方法有助于緩解該狀態(tài)。膠狀物是含纖維蛋白和纖維蛋白原的血清，可能是由于放置時間不夠，造成血清未完全析出。不建議直接吸取其中少量的清亮血清。

2 材料準(zhǔn)備

檢測使用96孔90°V型微量反應(yīng)板，要確保每個孔清潔，每次使用后要立即用清水沖洗孔中的反應(yīng)物，通過反復(fù)試驗證明：90°V型板相對于110°板及130°板來講，具有紅細(xì)胞沉降速度快，產(chǎn)生的凝集圖像清晰、結(jié)果容易判定等優(yōu)點。

3 移液槍的使用

（1）單道、多道可調(diào)微量移液槍，應(yīng)選擇合適的量程，以便精確度的提高。

（2）使用時，應(yīng)采用一檔吸液、二檔排液的方法。吸取液體時，槍頭要深入液下，緩慢平穩(wěn)吸液。加緩沖液時，應(yīng)加在板孔底部。倍比稀釋血清時，應(yīng)每孔至少反復(fù)吹吸6次，以便混合均勻。注意：盡量避免產(chǎn)生泡沫引起混合不均。加抗原及紅細(xì)胞時應(yīng)在板內(nèi)液面上方加樣，以免交叉污染，影響試驗結(jié)果。

（3）加樣、倍比稀釋時，應(yīng)高度集中注意力，以免漏加、重復(fù)加樣等。

4 試劑的保存及配制

（1）禽流感血凝抑制試驗所用的抗原、陽性血清應(yīng)嚴(yán)格按照說明書的要求進行保存和配置，試驗前應(yīng)提前將其恢復(fù)至室內(nèi)溫度?？乖谋４鏈囟葹?20 ℃，反復(fù)凍融會降低抗原的滴度，應(yīng)避免反復(fù)凍融。

（2）pH 7.2、0.01 mol/L的PBS液的制備：

①應(yīng)盡量現(xiàn)用現(xiàn)配；

②每次使用前應(yīng)測pH值，以免時間過長而導(dǎo)致pH值發(fā)生改變；

③由于pH試紙跨度范圍偏大，pH值不易準(zhǔn)確界定，最好采用酸度計準(zhǔn)確測量pH值，以提高試驗的精確度；

④全部試驗均采用同一種稀釋液。

（3）1%紅細(xì)胞制備的注意事項

①為避免雞只紅細(xì)胞發(fā)生自凝現(xiàn)象，在配制1%紅細(xì)胞懸液時，最好選擇采取2～3只SPF雞，或未進行過任何免疫的成年公雞血液。采血的前提條件是要按1/10采血量的比例在一次性注射器中加入抗凝劑，如，肝素、枸椽酸鈉、檸檬酸鈉等。

②采血完畢后，分裝至2 ml容量的圓底離心管中，因為通過2 ml與1.5 ml兩種容量離心管相比較，放入1.5 ml尖底離心管時，離心后，離心管底部紅細(xì)胞不易與加入的PBS液混勻，易沉積在管底部，達不到洗脫干凈的目的。

③經(jīng)2 000～3 000 r/min，5～10 min，棄去上液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再加入10倍以上血量的PBS液，上下緩慢顛倒（切忌用力過大使紅細(xì)胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復(fù)幾次，直至上清液清亮透明為止。

④在加紅細(xì)胞過程中，還須不斷輕搖，以確保紅細(xì)胞均勻，使其每孔加入相同數(shù)量的紅細(xì)胞。

⑤制備好的紅細(xì)胞液如果放置后上清液變紅，說明有溶血，不可再使用。

5 抗原液的配制

①先做血凝試驗測定效價，以抗原與紅細(xì)胞完全凝集的孔為1HUA抗原，配制4HUA抗原應(yīng)往前推算2孔，即除以4后的值。

②每次做試驗前，必須重新檢測禽流感抗原的血凝效價，以免效價發(fā)生改變而導(dǎo)致抗原稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致試驗結(jié)果不準(zhǔn)確。

③為保證配制的抗原準(zhǔn)確，還要進行抗原回滴試驗。具體方法：做2排抗原回滴，在2排的第1～8孔各加25 μl PBS，取4HAU抗原25 μl加在第2排的第1孔、第2孔，混勻，從第2孔倍比稀釋至第4孔，棄去25 μl，另一排同樣。從第2至第8孔補25 μl PBS，以保持75 μl總量不變，另一排同樣。2排的第1～8孔各加25 μl 1%紅細(xì)胞，震蕩10 s。靜置30 min觀察結(jié)果。這樣在第1孔為4HAU抗原，第2孔為2HAU抗原，第3孔為1HAU抗原，第4孔為1/2HAU抗原，均為75μl總量，第5～8孔為空白對照。如果抗原回滴試驗不成立，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整抗原濃度直至回滴試驗成立。原因：如果抗原濃度過高，則所測定的抗體效價水平偏低，如果抗原濃度過低，則所測定的效價偏高。所以不調(diào)整抗原濃度至實驗成立的話會對結(jié)果有很大影響。

6 結(jié)果判定

每次試驗必須設(shè)陽性及陰性（空白）對照血清，判別試驗是否成立。判讀結(jié)果時，將酶標(biāo)板傾斜45°，以孔底沉淀的紅細(xì)胞流動性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒為凝集完全抑制。

試驗器具的清洗每次試驗完畢后，應(yīng)將酶標(biāo)板中液體甩凈，然后用自來水反復(fù)沖凈每個孔，再放入3%NaOH中4 h，清水反復(fù)沖凈，再放入3%HCl中4 h，清水反復(fù)沖凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗幾次，甩干水分，入干燥箱中干燥備用。實驗用燒杯、加樣槽、量筒等也應(yīng)充分洗凈、干燥，以免器具內(nèi)有雜物、污物以及殘留物從而影響試驗結(jié)果。

7 體會

在進行禽流感血凝抑制試驗時，應(yīng)充分考慮到各方面的影響因素，提供的檢測結(jié)果才會真實可靠，準(zhǔn)確掌握禽類的免疫抗體水平，進而為科學(xué)防控禽流感提供理論依據(jù)。