葛志華 李俊玫 李俊穎 于海忠 楊 寧 王春艷

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院科研處，河北 承德 067000)

70%唾液和近50種生物活性物質(zhì)由下頜下腺分泌〔1〕，研究發(fā)現(xiàn)老年患者出現(xiàn)口干癥狀可能與衰老導致下頜下腺腺泡和導管細胞內(nèi)超微結構改變，外分泌功能明顯降低有關〔2〕。本研究所用何首烏飲由《宣明論》何首烏丸加味而成(炙何首烏、懷牛膝、肉蓯蓉、淫羊藿、丹參、茯苓),具有補肝腎、益精血、延年益壽之功效。研究發(fā)現(xiàn)，何首烏飲可使衰老大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力明顯升高，總抗氧化能力(T-AOC)增強，丙二醛(MDA)顯著降低；可改善衰老大鼠下頜下腺超微結構的衰老變化、抑制細胞凋亡而達到延緩細胞衰老、凋亡的目的〔2～5〕。近年發(fā)現(xiàn)細胞衰老與細胞內(nèi)染色體末端端粒長度密切相關，端粒酶再激活被認為是細胞逃脫衰老的重要機制。本文觀察何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺端粒酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 何首烏飲方劑所用中藥購自承德富爾康藥業(yè)有限公司；端粒酶活性檢測TRA-ELISA試劑盒，Roche公司；D-半乳糖，北京化學試劑公司；細胞裂解試劑盒，上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2實驗動物的選擇及分組 選用8周齡清潔級SD雌性大鼠20只，體重180～220 g，購自河北省實驗動物中心。將大鼠隨機分為正常組、模型組、何首烏飲預防組、何首烏飲治療組每組5只。

1.3模型的建立及各組動物的處理方法 正常組正常喂養(yǎng)60 d；模型組腹腔注射D-半乳糖300 mg·kg-1·d-1，連續(xù) 60 d；何首烏飲預防組稱重后腹腔注射D-半乳糖(量同模型組)同時灌胃何首烏飲1.936 g·100 g-1·d-1，水煎濃縮成0.6 ml·100 g-1·d-1，1次/d，連續(xù)60 d。何首烏飲治療組大鼠稱重后腹腔注射D-半乳糖(量同模型組)60 d后，灌胃何首烏飲1.936 g·100 g-1·d-1，水煎濃縮成0.6 ml·100 g-1·d-1，1次/d，連續(xù)60 d。各組大鼠末次給藥后1 h，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，分離并摘取下頜下腺，置液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4采用端粒重復擴增-微孔板雜交法檢測下頜下腺細胞端粒酶活性 取100 mg(-70℃ )冷凍下頜下腺組織，經(jīng)洗液漂洗、離心沉淀后加200 μl冷裂解液，自動勻漿器冰浴中勻漿，離心、移取上清液，-70℃保存。端粒序列的復制及TRAP擴增：每管加入約5 μl的細胞裂解液，25 μl混合物，5 μl內(nèi)標引物,用無DNAase的雙蒸水補至50 μl；25℃ 反應30 min，合成端粒酶延伸產(chǎn)物。然后加熱滅活端粒酶，加入0.1 μg CX和2 μl Taq酶進行PCR反應。產(chǎn)物的固相與雜交(包被、變性、雜交與顯色)取樣品和內(nèi)參對照PCR產(chǎn)物各2.5 μl于96孔板上，同時設空白裂解液和樣品滅活的對照，每孔加入10 μl變性液，樣品一分為二，分別加入100 μl雜交液T或100 μl雜交液IS，混合后，加入預處理過的96孔板中，封口，37℃ 300 r/min 2 h；吸去雜交液，用洗滌液洗3次，加入Anti-DIG-HRP工作液，300 r/min，室溫30 min；去雜交液。洗5次，加入TMB底物溶液，300 r/min室溫20 min；最后加入終止液，在30 min內(nèi)于450 nm處測吸光度值，按公式計算端粒酶的相對活性。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

正常組、模型組、何首烏飲預防組、何首烏飲治療組間端粒酶活性OD值(0.28±0.51，0.03±0.06，0.26±0.21，0.11±0.01)表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。多重比較結果顯示，模型組端粒酶OD值最低，正常組最高，何首烏飲預防組低于正常組，但高于其他各組(P<0.01)。

3 討 論

唾液具有消化功能和潤滑、防御、保護、抗菌及內(nèi)分泌作用。隨著年齡增長，下頜下腺會出現(xiàn)增齡性變化，唾液流量及成分亦將產(chǎn)生明顯的變化，致使唾液量減少而黏稠，導致口干，進而影響咀嚼和吞咽；防御、保護和抗菌作用減退可成為涎腺炎、蛀牙、牙周疾病和持續(xù)的口腔感染的影響因素〔6〕；衰老還可影響下頜下腺分泌生物活性物質(zhì)〔如神經(jīng)生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)等〕的功能，繼而引起其他一系列繼發(fā)性變化。因此，下頜下腺的抗衰老研究對衰老病人的涎腺功能減退性疾病的預防、治療具有重要意義。

近年發(fā)現(xiàn)細胞衰老與細胞內(nèi)染色體末端端粒長度密切相關，端粒存在于真核生物線形染色體末端，由串聯(lián)重復的短 DNA序列及其相關蛋白組成 DNA蛋白復合體。主要作用為防止染色體 DNA 降解、 末端融合缺失和非正常重組。端粒酶具有促進端粒延伸的作用，在沒有端粒酶的細胞中，端粒會逐漸縮短直至染色體損傷；有端粒酶存在的細胞，則端粒的長度能得以保持，使之處于一種不斷伸縮的動態(tài)平衡中〔7〕。在端粒酶處于抑制狀態(tài)的細胞分裂時，DNA 不完全復制會引起端粒DNA的少量丟失，隨著細胞分裂次數(shù)的增加，端粒不斷縮短。當端?？s短到一定程度(臨界長度)時引發(fā) Hayflick 極限，細胞不再分裂增殖而衰老死亡〔8〕。因此，端粒酶再激活被認為是細胞逃脫衰老的重要機制。

結果提示，組織端粒酶活性的下降是導致衰老的原因之一，而何首烏飲可提高衰老大鼠下頜下腺端粒酶活性，延緩端?？s短。

中醫(yī)學認為脾腎兩虛夾瘀是衰老的基本病機,作用于衰老的全部過程，脾腎兩虛是衰老的本質(zhì)，而瘀血的病理產(chǎn)物則是衰老在脾腎兩虛的前提下的必然結果。何首烏飲具有烏發(fā)，填精補髓功效。在此基礎上加淫羊藿補腎陽，強筋骨，丹參活血化瘀、養(yǎng)心安神，茯苓健脾化濕，以達到補肝腎、益精血、延年益壽之功效。已有研究顯示〔9，10〕何首烏飲方劑能延緩衰老大鼠卵巢細胞及腎臟細胞凋亡的發(fā)生。而本研究結果顯示何首烏飲延緩衰老的機制可能與其增加組織的端粒酶活性有關。

4 參考文獻

1何江才，姚國剛，賈雪梅.下頜下腺內(nèi)生物活性物質(zhì)的研究進展〔J〕.四川解剖學雜志，2000；8(4):217-21.

2葛志華，趙淑敏，楊桂梅，等.何首烏飲對 D-半乳糖所致衰老大鼠下頜下腺超微結構的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009； 29(14):1778-80.

3葛志華，孫立新，楊桂梅，等.何首烏飲對實驗性衰老大鼠下頜下腺 T-AOC、MDA的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(1):105-6.

4葛志華，許 倩，王春艷.何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺GSH-PX、MDA的影響〔J〕.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2011；38(51):850-6.

5李俊玫，高福祿，葛志華，等.何首烏飲對衰老大鼠下頜下腺凋亡的影響〔J〕.山東醫(yī)藥，2009； 49(48):34-5.

6Napenas JJ，Brennan MT，F(xiàn)ox PC.Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth)〔J〕.Odontology,2009;97(2):76-83.

7張 婷，王曉民.端粒、端粒酶的發(fā)現(xiàn)和意義〔J〕.首都醫(yī)科大學學報，2009；30(5):718-22.

8馬 宏，張宗玉，童坦君.衰老的生物學標志〔J〕.生理科學進展，2002；33(1):65-8.

9陳 雪，牛嗣云，曲銀娥，等.何首烏飲對衰老大鼠腎臟增殖與凋亡的影響 〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2009；20(3)：650-1.

10李亞麗，周利霞，張 娜，等.何首烏飲對亞急性衰老大鼠卵巢細胞凋亡及相關基因表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009；29(3):265-7.