駱瑩濱 吳建春 方志紅 朱詩國(guó) 李 雁.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，上海 0007；.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 003

赤芍水提物對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)研究

駱瑩濱1，2吳建春1方志紅1朱詩國(guó)2李 雁1
1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，上海 200071；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

目的 探討赤芍水提物對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)。 方法 選取人肺腺癌細(xì)胞A549、H1299以及小鼠Lewis肺腺癌細(xì)胞（LLC）為靶細(xì)胞，接種于 6 孔板或 96 孔板，接種密度為 5×104/孔和 3×103/孔，加入 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L不同濃度的赤芍水提物培養(yǎng)1～3 d，以0 g/L濃度的赤芍水提物處理組作為對(duì)照組，分別采用鏡下觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀以及細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。 結(jié)果 鏡下直接觀察，與對(duì)照組（0 g/L濃度）比較，不同濃度的赤芍水提物處理后肺癌細(xì)胞數(shù)量明顯較少，0.5 g/L濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，抑制率為43%（P<0.05）。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)顯示，經(jīng)赤芍水提物處理后，A549細(xì)胞周期阻滯于G1期。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，赤芍可以抑制LLC皮下移植瘤的生長(zhǎng)。 結(jié)論赤芍中藥可以抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

赤芍；肺癌；增殖抑制；抗腫瘤

活血化瘀中藥在腫瘤臨床治療中被廣泛地應(yīng)用。然而活血化瘀藥的應(yīng)用尚存爭(zhēng)議，因?yàn)槠渖婕暗绞欠衲艽龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移的問題[1-2]。本實(shí)驗(yàn)選取臨床中較為常用的一味活血化瘀中藥赤芍，檢測(cè)其對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制增殖情況，肺癌皮下移植瘤小鼠模型經(jīng)赤芍活血中藥治療后腫瘤生長(zhǎng)狀況，探討活血中藥赤芍與腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠，雄性，5周齡。購于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，并飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。10只C57BL/6小鼠隨機(jī)分對(duì)照組（5只，生理鹽水灌胃，每天200μL/只），赤芍組（5只，赤芍水提物200 g/L灌胃，每天200μL/只），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2 瘤細(xì)胞株

A549、H1299、肺腺癌（LLC）細(xì)胞株，購于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.3 赤芍水提物

赤芍水提物由上海市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，等份用PBS液配制成相當(dāng)于含生藥1 g/mL中藥液。根據(jù)提取物濃度，將其分為對(duì)照組（0 g/L），0.1 g/L濃度組、0.2 g/L濃度組、0.3 g/L濃度組、0.4 g/L濃度組、0.5 g/L濃度組、0.6 g/L濃度組、0.7 g/L濃度組、0.8 g/L濃度組、0.9 g/L濃度組、1.0 g/L濃度組。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

A549、H1299細(xì)胞按3×103接種于 96孔板，加入不 同 濃 度 梯 度 （0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L）的赤芍水提物，37℃，5%CO2，培養(yǎng) 24、48、72 h，培養(yǎng)體系為 100 μL，培養(yǎng)基為 DMEM（A549）及1640（H1299），培養(yǎng)液含有 10%新生小牛血清（Gibco，美國(guó)），每孔加入10μL CCK檢測(cè)試劑，4 h后酶標(biāo)儀掃描，掃描波長(zhǎng)為450 nm，每個(gè)濃度組樣本數(shù)為6。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

A549、H1299 細(xì)胞按 5×104接種于 6 孔板，37℃，5%CO2，培養(yǎng)24 h，于每孔中間劃一均勻大小的劃痕，加入0.5 g/L濃度的赤芍水提物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，光鏡下觀察細(xì)胞爬行能力。

1.6 流式細(xì)胞學(xué)細(xì)胞周期檢測(cè)

A549、H1299 按 5×104接種于 6 孔板，加入 0.5 g/L濃度的赤芍水提物，37℃，5%CO2，培養(yǎng) 24 h，收集細(xì)胞，采用細(xì)胞周期試劑盒（碧云天）進(jìn)行染色，上流式檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.7 動(dòng)物處理

將10只C57BL/6黑鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（5只，生理鹽水灌胃，每天 200μL/只），赤芍組（5只，赤芍水提物200 g/L灌胃，每天200μL/只）。每只小鼠腋下皮下接種3×106LLC細(xì)胞。第2天赤芍組予赤芍水提物200 g/L灌胃，每天1次，每次200μL，灌胃 40 d；對(duì)照組予0.9%生理鹽水灌胃，每天1次，每次200μL，灌胃40 d。第3天開始通過游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下移植瘤體積大小，根據(jù)公式[3]計(jì)算瘤體體積：V=（π/8）a×b2，其中，V=腫瘤體積，a=瘤塊最長(zhǎng)直徑，b=瘤塊最短直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 12.0對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，重復(fù)測(cè)量的計(jì)量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

96 孔板中每孔鋪3000個(gè)細(xì)胞，A549、H1299細(xì)胞在 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L 不同濃度的赤芍水提物處理24、48、72 h后，加入CCK-8試劑，分別檢測(cè)其對(duì)不同NSCLC細(xì)胞系的抑制效應(yīng)，并與對(duì)照組（0 g/L濃度）比較，計(jì)算其抑制率。結(jié)果顯示隨著赤芍水提物濃度的增加，A549、H1299細(xì)胞增殖受到抑制。0.5 g/L濃度組對(duì)A549細(xì)胞存在最大的抑制生長(zhǎng)作用，但不同濃度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故赤芍水提物對(duì)A549的抑制不呈劑量依賴。H1299隨著赤芍濃度的增加，細(xì)胞增殖逐漸下降，有明顯的增殖抑制效應(yīng)。而且高濃度組（1 g/L濃度）與低濃度組（0.1 g/L濃度）比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），故赤芍水提物對(duì)H1299的抑制呈一定的劑量依賴。見圖1。

圖1 赤芍水提物對(duì)A549、H1299細(xì)胞增殖的影響

2.2 鏡下直接觀察

細(xì)胞貼壁后加入0.5g/L濃度藥物，作用24后，電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化：對(duì)照組（0 g/L濃度）細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，排列緊密，形態(tài)成梭形，細(xì)胞之間形成連接。赤芍水提物0.5 g/L濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏，大部分細(xì)胞成皺縮狀態(tài)，數(shù)量更少，細(xì)胞連接大大減少。見圖2。

2.3 流式細(xì)胞周期檢測(cè)

圖2 赤芍水提物對(duì)A549細(xì)胞電鏡下細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）

圖3 赤芍水提物對(duì)A549、H1299細(xì)胞周期影響

赤芍對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制效應(yīng)，為明確對(duì)細(xì)胞的抑制周期，進(jìn)行流式分析。0.5 g/L濃度藥物處理細(xì)胞24 h后，收集5×105細(xì)胞按流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒protocol處理后，上BD流式儀檢測(cè)，結(jié)果顯示，經(jīng)0.5 g/L濃度組處理的A549和H1299細(xì)胞和對(duì)照組（0 g/L濃度）相比，細(xì)胞周期的分布比例發(fā)生變化，A549細(xì)胞G1期細(xì)胞比例由48%上升到86%，H1299細(xì)胞G1期細(xì)胞比例由39%上升到60%，可見赤芍誘導(dǎo)A549和H1299細(xì)胞阻滯于G1期。見圖3。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

為研究活血化瘀中藥對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，細(xì)胞貼壁后，劃一粗細(xì)大小一致的劃痕，對(duì)赤芍處理后的A549細(xì)胞進(jìn)行劃痕遷移實(shí)驗(yàn)，加入0.5 g/L藥物作用24 h后，電鏡下觀察。結(jié)果顯示，0.5 g/L濃度組與對(duì)照組（0 g/L濃度）相比，A549細(xì)胞爬行能力和遷移能力明顯降低。說明赤芍處理顯著降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移能力。見圖4。

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

圖4 赤芍水提物對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響（100×）

小鼠隨機(jī)分成兩組后，將3×106LLC細(xì)胞接種于小鼠背部皮下，赤芍組予中藥每日灌胃，對(duì)照組予生理鹽水每日灌胃，每次200μL，每3天測(cè)量1次瘤體大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。體外實(shí)驗(yàn)表明，赤芍水提物能一定程度抑制非細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明赤芍能抑制LLC肺癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)。見圖5。

圖5 赤芍水提物對(duì)C57BL/6荷瘤鼠體內(nèi)抑瘤能力影響

3 討論

活血化瘀中藥在腫瘤臨床治療中的應(yīng)用還存在不同的爭(zhēng)議，究竟腫瘤患者是否可以使用活血化瘀中藥尚不明確。鄭平菊等[4]認(rèn)為活血化瘀改善了腫瘤的血液供應(yīng)，減少了細(xì)胞凋亡，就等于減少了增殖和轉(zhuǎn)移的刺激和壓力。也有學(xué)者認(rèn)為，某些活血化瘀方藥有促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移、降低免疫功能及加重出血的作用，認(rèn)為在細(xì)胞免疫功能減退時(shí)，使用抗凝劑包括活血化瘀藥溶解血栓及癌栓，可使癌栓中癌細(xì)胞釋放入血，耗竭機(jī)體免疫力，加速血行播散[5]。赤芍為毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根，具有清熱涼血、通經(jīng)及清肝消癰的功效，主治瘀滯經(jīng)閉、癥瘕積聚、腹痛脅痛、衄血血痢、腸風(fēng)下血、目赤癰腫，為臨床中較為常用的一味活血化瘀中藥。有學(xué)者[6]對(duì)其門診552例肝癌患者用藥分析發(fā)現(xiàn)，赤芍是其處方中最為常用的活血化瘀中藥之一。其藥效成分主要是以芍藥苷為主的單萜及其苷類成分、沒食子酸及其衍生物等[7]。現(xiàn)代藥理研究表明，赤芍具有多種藥理功能，主要作用于心血管系統(tǒng)，另外還具有抗腫瘤、抗內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)免疫等功效。Sheng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，赤芍水提物可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)生凋亡，并具有一定的時(shí)間和劑量依賴性，主要表現(xiàn)在G1期的細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，Bax和p53基因表達(dá)上調(diào)，促細(xì)胞凋亡蛋白酶caspases-3和9被激活。Xu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，赤芍抗腫瘤誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制是Bc-l-2與Bc-l-Xl含量降低，能夠促進(jìn)MPT開放和降低線粒體Δφm，進(jìn)而促使Cyto-C和AIF從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)，并增加了ROS的生成，降低胞內(nèi)GSH含量并促進(jìn)其向胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，caspase-3被激活和降解PARP。Bax含量增加可以構(gòu)成跨線粒體外膜的孔，并導(dǎo)致膜電位的降低和細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子的外流，細(xì)胞色素C與Apaf-1和ATP及pro-caspase-9形成復(fù)合物并導(dǎo)致caspase-9的激活。與細(xì)胞色素C的結(jié)合使Apaf-1與pro-caspase-9的結(jié)合能力更強(qiáng)[10-11]。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，赤芍能明顯抑制S180腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并能通過增加血清IL-2和IL-4的水平增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。較多實(shí)驗(yàn)都表明赤芍具有一定的腫瘤抑制效應(yīng)。不過丁罡等[13]發(fā)現(xiàn)，赤芍中藥具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，但其能促進(jìn)大鼠移植瘤高表達(dá)VEGF及腫瘤血管的形成，腫瘤細(xì)胞侵入結(jié)構(gòu)、功能不完全的腫瘤血管，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但也有學(xué)者[14]認(rèn)為活血化瘀使纖維蛋白原溶解，血小板解聚，降低血黏度，改善癌灶周圍微循環(huán)，防止癌細(xì)胞粘著，具有防止腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：赤芍中藥能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及遷移，能將細(xì)胞明顯阻滯于G1期，并能有效抑制C57BL/6黑鼠肺癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過采用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，初步探討了活血化瘀中藥與肺癌腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為臨床選擇性地應(yīng)用活血化瘀中藥抗腫瘤治療提供科學(xué)依據(jù)。

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Inhibition effect study of aqueous extract from Paeonia veitchii on lung cancer cell

LUOYingbin1,2WUJianchun1FANGZhihong1ZHUShiguo2LIYan1

1.Department of Oncology,ShanghaiChinese Medicine Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China;2.School of Basic Medical Sciences,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

ObjectiveTo study the inhibition effect of aqueous extract from Paeonia veitchii on lung cancer cell growth.M ethods A549,H1299,LLC cellswere separately seeded in 6-well plates or 96-well plates.Different concentration (0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 g/L)aqueous extract from Paeonia veitchii were added into culture system,with 0 g/L concentration group as control group.At different time point,the cellmorphology,proliferation and apoptosiswere detected bymicroscopy,CCK-8 kit,flow cytometry.Results Compared to control group(0 g/L),the cell number of Paeonia veitchii treated group obviously decreased and the growth inhibitory effectwas about 43% (P<0.05).The cellmorphology was lost and cells cycle was inhibited in G1phase.Animal experiments showed that the growth of LLC tumors could be inhibited by Paeonia veitchii.Conclusion Paeonia veitchii aqueous extracthas a certain inhibitory effect on lung cancer cell growth.

Paeonia veitchii;Lung cancer;Proliferation inhibition;Anti-tumor

R734.2

A

1673-7210（2014）12（c）-0021-05

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)14ZR 1439000）。

駱瑩濱（1987-），男，浙江武義人，上海中醫(yī)藥大學(xué)2010級(jí)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)專業(yè)在讀博士生；研究方向：中醫(yī)藥防治惡性腫瘤。

李雁（1961-），男，浙江溫州人，博士，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師；研究方向：中醫(yī)藥防治惡性腫瘤等。

2014-09-01 本文編輯：衛(wèi) 軻）