劉紹祖，佟 明，張 騫，張 蓮，徐 奔，李自智，黃偉超，金艷陽遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 00；北京大學(xué)第一醫(yī)院，北京 00034

PCDH10基因在前列腺癌組織中的甲基化測(cè)定及臨床意義

劉紹祖1，佟 明1，張 騫2，張 蓮2，徐 奔2，李自智1，黃偉超1，金艷陽1
1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001；2北京大學(xué)第一醫(yī)院，北京 100034

目的檢測(cè)PCDH10基因在前列腺癌組織中的甲基化狀態(tài)，并分析其臨床意義。方法應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)技術(shù)檢測(cè)PCDH10基因在3株前列腺癌細(xì)胞系、1株前列腺上皮細(xì)胞、13例前列腺增生組織和40例前列腺癌組織樣本中的甲基化情況，同時(shí)分析40例前列腺癌患者的臨床資料。結(jié)果3株前列腺癌細(xì)胞系中有2株檢出PCDH10基因甲基化；40例前列腺癌樣本中24例(60%)檢出PCDH10基因甲基化，13例前列腺增生組織中未檢出PCDH10基因甲基化。PCDH10基因出現(xiàn)甲基化患者與未出現(xiàn)甲基化患者相比，在年齡、前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)和臨床分期等指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但在Gleason評(píng)分的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論P(yáng)CDH10基因在前列腺癌組織中甲基化程度較高，高Gleason評(píng)分的前列腺癌可能具有更高的PCDH10基因甲基化率，提示PCDH10基因甲基化可能與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

甲基化；PCDH10基因；前列腺癌；甲基化特異性；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

前列腺癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率在我國呈上升趨勢(shì)。在美國，前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為危害男性健康腫瘤的第1位。前列腺癌的具體發(fā)病機(jī)制不詳，待患者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)而到醫(yī)院就診時(shí)，往往已發(fā)展到中晚期階段，失去了早期診斷、治療的機(jī)會(huì)。目前廣泛應(yīng)用的前列腺特異抗原(prostate- specific antigen，PSA)檢測(cè)雖然對(duì)前列腺癌的診斷有重要價(jià)值，但其特異性并不十分理想。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的主要修飾方式之一，在基因表達(dá)的調(diào)控、基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定等方面有重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[1]。國外研究還發(fā)現(xiàn)前列腺癌的惡性程度與DNA甲基化密切相關(guān)[2]。因此深入研究甲基化改變與前列腺癌的關(guān)系對(duì)其診斷有重要意義。PCDH10基因位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)8帶上，其異常甲基化已被證實(shí)在胃癌、血液系統(tǒng)腫瘤、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、大腸癌的發(fā)生發(fā)展中均有著重要的意義[3-4]；而在泌尿系統(tǒng)腫瘤的研究中，也發(fā)現(xiàn)PCDH10基因的異常甲基化與膀胱癌的發(fā)生同樣存在密切的關(guān)系[5-9]。然而，PCDH10基因在前列腺癌中的甲基化情況尚無相關(guān)報(bào)道，故本項(xiàng)研究以前列腺癌為研究對(duì)象，探討PCDH10基因在前列腺癌中的甲基化狀態(tài)，并進(jìn)一步了解其與前列腺癌患者年齡、前列腺特異性抗原、Gleason評(píng)分、臨床分期的關(guān)系，從而為確定前列腺癌的發(fā)病機(jī)制和早期生物學(xué)診斷提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 標(biāo)本來源 收集2012年9月- 2013年5月在遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科住院并行腹腔鏡前列腺癌根治術(shù)或經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)患者的術(shù)后標(biāo)本，其中前列腺癌組40例，年齡56～88歲，平均72歲，均經(jīng)B超及病理穿刺活檢或病理切片證實(shí)。Jewett臨床分期：B期6例，C期14例，D期20例。良性前列腺增生組13例，年齡59 ～ 83歲，平均73歲，均經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)后病理診斷證實(shí)。所有標(biāo)本均于術(shù)后0.5 ～ 1 h取下，并迅速置于液氮盒中，編號(hào)登記完畢后置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存。2 細(xì)胞系制備 選取Du145、PC3、Lncap共3株前列腺癌細(xì)胞系，以及人類正常前列腺細(xì)胞系RWPE-1共1株。細(xì)胞系的制備按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的程序進(jìn)行，將細(xì)胞復(fù)蘇后置于含有10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)液中，在37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3 組織DNA提取 將樣本從-80℃冰箱中取出，將前列腺癌及前列腺增生組織剪成小塊，加裂解液混勻。采用TIANGEN公司的DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)，嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行組織中DNA的提取，提取后用紫外分光光度儀檢查DNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢查完整性。

4 DNA亞硫酸鹽修飾 將提取好的DNA樣本溶解于30 μl的TE緩沖液中，后加入3.3 μl的NaOH溶液，37℃水浴鍋中加熱15 min。同時(shí)，新鮮配制4.2 mol/L的亞硫酸氫鈉溶液，并用3 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，新鮮配制10 mmol/L的氫醌溶液，同樣調(diào)節(jié)pH為5.0 ～ 5.2；將333 μl亞硫酸鹽修飾液加入到DNA樣本中溶解、混勻，加3滴礦物油至管頂端，55℃水浴鍋中加熱4 h，最后5 min將全部樣本取出，置于99℃烤箱上烘烤3 min，并輕彈離心管管帽上的液體，使之充分混勻。加熱畢，取Qiagen試劑盒中1 000 μl QXI溶液于樣本中，再加入40 μl QiaexⅡ溶液于樣本中，室溫下振蕩1 h充分混勻，再依次加入1 ml和500 μl的PE溶液洗滌DNA 2次，再加入50 μl TE緩沖液，充分溶解DNA，室溫下放置5 min。向樣本中加入5.56 μl的3 mol/L NaOH溶液，再次置入37℃水浴鍋中加熱15 min，之后加入27.78 μl的9 mol/L NH4OAc溶液，并用50 μl的3 mol/L NaOH溶液矯正pH＜7.0。加入1 000 μl QXI溶液，室溫下振蕩混勻20 min，再加入500 μl PE溶液洗滌DNA 2次，最后將亞硫酸鹽修飾后的DNA溶解于50 μl TE緩沖液中，室溫下放置5 min后，統(tǒng)一儲(chǔ)存在-20℃冰箱中備用。

5 甲基化特異性PCR 以亞硫酸鹽修飾后的DNA作為模板，借助Primer5.0軟件設(shè)計(jì)甲基化和非甲基化特異性引物，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體引物序列及反應(yīng)條件見表1。之后在前列腺癌細(xì)胞系和前列腺癌樣本中分別行熱啟動(dòng)PCR擴(kuò)增，以ddH2O作為空白對(duì)照。反應(yīng)體系 12.5 μl如下 ：5×buffer 2 μl、MgCl21 μl、dNTP 1μl、5'引 物 0.75 μl、3'引 物 0.75 μl、Taq-Gold 酶 0.093 75 μl、模板 0.5 μl、補(bǔ)去離子水6.406 25 μl。擴(kuò)增后取10 μl MSP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠溶液中染色。紫外燈下觀察結(jié)果并截取圖片。

表1 MSP中PCDH10基因的引物及退火條件Tab. 1 Sequences of primers and annealing conditions in PCDH10 gene for methylation-speci fi c PCR

結(jié) 果

1 PCDH10基因在細(xì)胞系中的MSP 1株正常前列腺上皮細(xì)胞系未出現(xiàn)PCDH10基因的甲基化，3株前列腺癌細(xì)胞系中2株出現(xiàn)PCDH10基因的甲基化，見圖1。

2 PCDH10基因在前列腺癌組織樣本中的MSP 40例手術(shù)切除的前列腺癌樣本中24例(60%)出現(xiàn)PCDH10基因甲基化(圖2)。13例前列腺增生組織中未檢測(cè)到PCDH10基因甲基化(圖3)。二者相比，PCDH10基因甲基化率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.404，P=0.02)。

圖 1 PCDH10基因在細(xì)胞系中的MSP結(jié)果Fig. 1 Methylation-speci fi c PCR showing PCDH10 gene in different cell lines

圖 2 PCDH10基因在40例前列腺癌組織樣本中的MSP結(jié)果Fig. 2 Methylation-speci fi c PCR showing PCDH10 gene in 40 PCa tissue samples

圖 3 PCDH10基因在13例前列腺組織樣本中的MSP結(jié)果Fig. 3 Methylation-specific PCR showing PCDH10 gene in 13 prostate tissue samples

3 PCDH10基因甲基化與臨床病理因素的關(guān)系進(jìn)一步分析24例PCDH10基因出現(xiàn)甲基化的患者臨床資料，并與余下16例PCDH10基因未出現(xiàn)甲基化的患者資料進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩組患者的Gleason評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=75.998，P＜0.05)，而在不同年齡、前列腺特異性抗原(PSA)和臨床分期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.111、0.372和1.975，P均＞0.05)。見表2。

表2 PCDH10基因甲基化與前列腺癌臨床病理間的關(guān)系Tab. 2 Relation between methylation of PCDH10 gene and clinicopathology of prostate cancer

討 論

眾多的研究已表明，DNA甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中占有重要的地位，其中抑癌基因啟動(dòng)子CpG島的高度甲基化被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞發(fā)生過程中較基因內(nèi)突變和染色體丟失的更早期事件[10]。而在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，也存在眾多具有明顯甲基化傾向的抑癌基因，但目前已經(jīng)報(bào)道的與前列腺癌表觀遺傳學(xué)改變相關(guān)的基因，如 GDF15、MC5R、KIAA0182、LOC100130872、ALDH1A3、CLDN8、SPON2等甲基化水平均不理想。因此，研究相關(guān)基因在前列腺癌中的表達(dá)和甲基化情況，對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)前列腺癌的發(fā)病機(jī)制十分重要，也有助于發(fā)現(xiàn)新型的早期診斷指標(biāo)。

PCDH10基因(OL-PCDH、KIAA1400)是原鈣黏素基因家族中的成員，由5個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)約42.26 kb。原鈣黏素是一種介導(dǎo)細(xì)胞黏附的細(xì)胞受體，而細(xì)胞黏附作用已被證實(shí)在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[11]。這個(gè)家族最早于2000年由Wu和Maniatis[12]首先報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)，該家族參與了細(xì)胞生命中各種重要角色，包括細(xì)胞分化、識(shí)別、排斥和誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附等。隨后由Wolverton和Lalande[13]詳細(xì)報(bào)道了該家族中PCDH10基因的作用，認(rèn)為其主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。后續(xù)的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PCDH10基因是一個(gè)在所有成年人正常組織中均可廣泛表達(dá)的抑癌基因，而體內(nèi)和體外試驗(yàn)也已證實(shí)PCDH10基因可以直接影響腫瘤的生成和侵襲。但對(duì)于PCDH10基因如何抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制尚不明確，一些學(xué)者認(rèn)為，位于PCDH10基因啟動(dòng)子5'側(cè)一個(gè)長(zhǎng)度約462 bp片段的區(qū)域具有高密度的CpG島，CpG島發(fā)生DNA甲基化可能導(dǎo)致抑癌作用的失活，而Sp1/Sp3和CBF/NF-Y轉(zhuǎn)錄因子也可能在其中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[14]。此外，PCDH10基因的沉默通過減弱機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞遷移的抑制作用，也可能參與了癌癥的發(fā)生與發(fā)展[15]。與此同時(shí)，與PCDH10同屬黏附蛋白家族TSG區(qū)域的一些基因如CDH1、CDH4、CDH13、FAT等也在實(shí)體腫瘤中存在高度的甲基化，其中CDH13基因甲基化已證實(shí)與前列腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16-18]。因此上述TSG區(qū)域的基因很有可能共同參與了PCDH10基因甲基化對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響。

本研究結(jié)果顯示PCDH10基因無論在前列腺癌細(xì)胞系還是前列腺組織樣本中均表現(xiàn)出了較高的甲基化程度，PCDH10基因在前列腺癌中Gleason評(píng)分8 ～ 10分組的甲基化率明顯高于4 ～7分組，由此可推測(cè)，該基因甲基化在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中起著潛在的作用，提示病理分期越高的前列腺癌患者，更容易發(fā)生PCDH10基因甲基化。近期Qu等[6]報(bào)道，PCDH10基因在胃癌中更傾向在早期的腫瘤中發(fā)生甲基化，而且具有甲基化的患者常常預(yù)后更差。由于我們?nèi)狈?duì)上述患者的長(zhǎng)期隨訪資料，因此PCDH10基因甲基化對(duì)前列腺癌患者預(yù)后的影響尚不清楚。

Matsuda等發(fā)現(xiàn)，低密度的CpG島甲基化只能使基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，只有當(dāng)基因的CpG島甲基化達(dá)到一定比例(＞60%)時(shí)，才足以完全關(guān)閉基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[19]。我們的研究結(jié)果表明，該基因在前列腺癌和良性前列腺增生中的甲基化率分別為60.0%和0，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其甲基化率在不同年齡、前列腺特異性抗原和不同臨床分期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。事實(shí)上，在其他實(shí)體腫瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)，PCDH10基因可以在癌旁組織中出現(xiàn)甲基化，這提示該基因可能在腫瘤早期即發(fā)生了變化，具有強(qiáng)烈的提示意義，但在完全正常的組織中目前尚未有該基因出現(xiàn)異常甲基化的報(bào)道，提示PCDH10基因在診斷惡性腫瘤方面具有較強(qiáng)的特異性。因此有理由認(rèn)為：前列腺組織中若檢出PCDH10基因甲基化，則需考慮存在前列腺癌的可能，為前列腺癌的診斷提供一定的參考價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)不足，缺少隨訪的相關(guān)信息，使得我們很難得出PCDH10基因甲基化與患者生存率的關(guān)聯(lián)信息，上述內(nèi)容將在我們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中加以完善，從而更好地判斷PCDH10基因甲基化對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。此外，已有學(xué)者在血、尿樣本中檢測(cè)RASSF1A、Tim-3、CDH1等基因的甲基化情況[20-21]。我們也將進(jìn)一步嘗試在血、尿等樣本中檢測(cè)PCDH10基因的甲基化情況，爭(zhēng)取為前列腺癌的早期診斷提供新的分子靶標(biāo)。

1 Gnyszka A， Jastrzebski Z， Flis S. DNA methyltransferase inhibitors and their emerging role in epigenetic therapy of Cancer［J］.Anticancer Res， 2013， 33（8）： 2989-2996.

2 Ahmed H. Promoter Methylation in Prostate Cancer and its Application for the Early Detection of Prostate Cancer Using Serum and Urine Samples［J］. Biomark Cancer， 2010， 2010（2）：17-33.

3 Li Z， Chim JC， Yang M， et al. Role of PCDH10 and its hypermethylation in human gastric Cancer［J］. Biochim Biophys Acta， 2012， 1823（2）： 298-305.

4 Williams EO， Sickles HM， Dooley AL， et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System［J］.Front Neural Circuits， 2011， 5 ：9.

5 Fang S， Huang SF， Cao J， et al. Silencing of PCDH10 in hepatocellular carcinoma via de novo DNA methylation independent of HBV infection or HBX expression［J］. Clin Exp Med， 2013， 13（2）：127-134.

6 Qu Y， Dang S， Hou P. Gene methylation in gastric cancer［J］. Clin Chim Acta， 2013， 424 ：53-65.

7 Yu B， Yang H， Zhang C， et al. High-resolution melting analysis of PCDH10 methylation levels in gastric， colorectal and pancreatic cancers［J］. Neoplasma， 2010， 57（3）： 247-252.

8 Ma JG， He ZK， Ma JH， et al. Downregulation of protocadherin-10 expression correlates with malignant behaviour and poor prognosis in human bladder Cancer［J］. J Int Med Res， 2013， 41（1）： 38-47.

9 Zhong X， Zhu Y， Mao J， et al. Frequent epigenetic silencing of PCDH10 by methylation in human colorectal Cancer［J］. J Cancer Res Clin Oncol， 2013， 139（3）： 485-490.

10 Gopalakrishnan S， Van Emburgh BO， Robertson KD. DNA methylation in development and human disease［J］. Mutat Res，2008， 647（1-2）：30-38.

11 Beadling C， Patterson J， Justusson E， et al. Gene expression of the IGF pathway family distinguishes subsets of gastrointestinal stromal tumors wild type for KIT and PDGFRA［J］. Cancer Med， 2013， 2（1）：21-31.

12 Wu Q， Maniatis T. Large exons encoding multiple ectodomains are a characteristic feature of protocadherin genes［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2000， 97（7）： 3124-3129.

13 Wolverton T， Lalande M. Identification and characterization of three members of a novel subclass of protocadherins［J］. Genomics，2001， 76（1-3）： 66-72.

14 Li Z， Xie J， Li W， et al. Identification and characterization of human PCDH10 gene promoter［J］. Gene， 2011， 475（1）： 49-56.

15 Bertrand KC， Mack SC， Northcott PA， et al. PCDH10 is a candidate tumour suppressor gene in medulloblastoma［J］. Childs Nerv Syst，2011， 27（8）： 1243-1249.

16 Vasiljevi? N， Wu K， Brentnall AR， et al. Absolute quantitation of DNA methylation of 28 candidate genes in prostate Cancer using pyrosequencing［J］. Dis Markers， 2011， 30（4）： 151-161.

17 Ianni M， Porcellini E， Carbone I， et al. Genetic factors regulating inflammation and DNA methylation associated with prostate Cancer［J］. Prostate Cancer Prostatic Dis， 2013， 16（1）： 56-61.

18 Gillio-Tos A， Fiano V， Zugna D， et al. DNA methyltransferase 3b（DNMT3b）， tumor tissue DNA methylation， Gleason score， and prostate cancer mortality ： investigating causal relationships［J］.Cancer Causes Control， 2012， 23（9）：1549-1555.

19 Ouyang B， Baxter CS， Lam HM， et al. Hypomethylation of dual specificity phosphatase 22 promoter correlates with duration of service in firefighters and is inducible by low-dose benzo［a］pyrene［J］.J Occup Environ Med， 2012， 54（7）：774-780.

20 Van Rij S， Dowell T， Nacey J. PSA screening in New Zealand ： total population results and general practitioners’ current attitudes and practices［J］. N Z Med J， 2013， 126（1381）： 27-36.

21 趙瑜，李紅華，王全順，等．慢性白血病Id4甲基化研究［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（1）：43-44．

Methylation of PCDH10 gene in prostate cancer tissue and its clinical signi fi cance

LIU Shao-zu1, TONG Ming1, ZHANG Qian2, ZHANG Lian2, XU Ben2, LI Zi-zhi1, HUANG Wei-chao1, JIN Yan-yang1
1First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Peking University First Hospital,Beijing 100034, China

TONG Ming. Email: Dongmingmir@163.com; ZHANG Qian. Email: zhangqianbmu@vip.sina.com

ObjectiveTo detect the methylation of PCDH10 gene in prostate cancer (PCa) tissue and analyze its clinical significance.MethodsMethylation of PCDH10 gene was detected in 3 PCa cell lines, 1 prostate epithelial cell line, 13 hyperplasic prostatic tissue samples and 40 PCa tissue samples by methylation-specific PCR. Clinical data about the 40 PCa patients were analyzed.ResultsMethylation of the PCDH10 gene was detected in 2 out of the 3 PCa cell lines and in 24 out of the 40 PCa tissue samples with a detection rate of 67.7% and 60.0%, respectively. However, no methylation of the PCDH10 gene was detected in the 13 hyperplasic prostatic tissue samples. No significant difference was found in the age, prostate specific antigen (PSA), and clinical stage between those with or without methylation of the PCDH10 gene (P＜0.05). The Gleason score was significantly higher in patients with methylation of the PCDH10 gene than in those without methylation of the PCDH10 gene (P＜0.05).ConclusionThe incidence of PCDH10 gene methylation is rather high in PCa patients. The methylation rate of PCDH10 gene is related with the higher Gleason score, suggesting that PCDH10 gene methylation is related with the pathogenesis and progression of PCa.

methylation; PCDH10 gene; prostate cancer; methylation-specific; polymerase chain reaction

R 737.25

A

2095-5227(2014)04-0379-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.04.022

時(shí)間：2014-01-21 15:36 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140121.1536.003.html

2013-10-22

劉紹祖，男，碩士，住院醫(yī)師。研究方向：前列腺癌的治療及發(fā)病機(jī)制。Email: 229781855@qq.com

佟明，男，博士，主任醫(yī)師，教授。Email: Dongmingmir@163.com；張騫，男，博士，主任醫(yī)師，教授。Email: zhangqianbmu@vip.sina.com