賈可敬，李湘洲，殷 凱

(中南林業(yè)科技大學 材料科學與工程學院，湖南 長沙 410004)

竹葉中的黃酮類化合物具有抑制脂質(zhì)過氧化、抗菌[1]、免疫調(diào)節(jié)[2-3]、保護心腦血管[4]、降血脂[5]、保護肝臟[6]和清除自由基等功能[7-9]。隨著人類對自身保健和養(yǎng)生方面的關(guān)注度越來越高，以天然黃酮為主打或者作為添加劑的產(chǎn)品將會倍受人們的青睞。

長沙青皮竹Bambusa textilisvar.persistens.B.M.Yang是一種生長在湖南長沙的青皮竹變種[10]，目前對其的研究報道僅限于作為觀賞竹種的植物學分類方面，其他方面的研究報道卻極少，而有關(guān)竹葉提取物的研究卻已成為當今熱門的相關(guān)研究領域。因此，對長沙青皮竹葉提取物中活性成分的研究具有一定的現(xiàn)實意義。

目前，黃酮或竹葉黃酮的提取方法有水提法、醇提法、微波輔助提取、超聲輔助提取、酶法、超臨界萃取和其他新方法[11-19]。為了給長沙青皮竹葉中黃酮類化合物的進一步研究提供參考依據(jù)，文中采用正交試驗設計法，就乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時間和固液比例等提取工藝條件對黃酮得率的影響情況進行了試驗研究，并采用紫外分光光度法對黃酮類化合物進行了量化分析，以期為長沙青皮竹的加工利用提供必要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的長沙青皮竹、毛竹、假毛竹、斑竹、水竹和琴絲竹葉均于2012年10月采自中南林業(yè)科技大學竹園，經(jīng)晾干、粉碎，過60目篩，密封以備用。對照品蘆丁購自湖南省食品藥品鑒定研究院。

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95％乙醇、石油醚(30～60℃)等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

721N型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；AUY220型電子分析天平，日本島津；HH-S1s型恒溫水浴鍋，金壇市大地自動化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)型真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 蘆丁標準曲線

參照文獻[20]中的方法并稍加改進，取10.8mg的蘆丁溶于100mL的30％乙醇溶液中，得到質(zhì)量濃度為108mg?L-1的蘆丁標準液。分別取 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0mL的蘆丁標準液置于6個25mL的容量瓶中，用30％的乙醇溶液稀釋至8mL；加入濃度為50g?L-1的NaNO2溶液1mL，靜置6min，再加入濃度為100g?L-1的Al(NO3)3溶液1mL，靜置6min后再加入40g?L-1的NaOH溶液10mL，最后用30％的乙醇溶液定容，靜置10min，在510nm波長處測定吸光度。得到如下蘆丁標準方程：

式中：A為吸光度，C為質(zhì)量濃度(mg?L-1)；R2為0.999 9。蘆丁乙醇溶液在0.00～34.56mg?L-1的范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好。

1.3.2 單因素試驗方法

采用乙醇為提取劑，以竹葉黃酮得率為指標，考察了乙醇濃度、提取時間、固液比例和提取次數(shù)對黃酮得率的影響情況。提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，以石油醚多次萃取葉綠素至石油醚無色，取下層液定容。移取一定體積溶液，按照“1.3.1”中說明的方法測定黃酮濃度，計算黃酮得率。各因素平行試驗5次，取其平均值。

1.3.3 黃酮濃度及得率的計算

黃酮濃度的計算公式為：

黃酮提取率的計算公式為：

式(1)中：A為吸光度，C表示黃酮的質(zhì)量濃度(mg?L-1)。式(2)中：C亦為黃酮的質(zhì)量濃度(mg?L-1)，M竹葉為竹葉的質(zhì)量(mg)，V總為粗提液的定容體積，V取為移取用于測定黃酮濃度的粗提液的體積，0.025表示25mL容量瓶的體積(單位為L)。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)和固液比(D)作為試驗因素，按照如表1的四因素三水平的正交試驗方案進行長沙青皮竹葉黃酮提取工藝的優(yōu)化試驗。采用統(tǒng)計分析軟件SPSS v19.0對試驗結(jié)果進行分析，以確定最佳提取工藝。

表1 試驗因素與試驗水平Table 1 Test factors and levels

1.3.5 6種竹葉中黃酮含量的比較分析

根據(jù)正交試驗結(jié)果，采用優(yōu)化工藝，對長沙青皮竹、毛竹、假毛竹、斑竹、水竹和琴絲竹這6種竹竹葉中的黃酮類化合物進行提取，測定其中的黃酮濃度，計算并比較竹葉中的黃酮含量，每種竹葉平行測定5次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果及分析

2.1.1 乙醇濃度對黃酮得率的影響

乙醇濃度對黃酮得率的影響結(jié)果見表2。由表2可知，黃酮得率隨著乙醇濃度的增加而逐漸增大。當乙醇濃度為70％時，黃酮得率達到最大值；但當乙醇濃度再增大時，黃酮類化合物的提取率反而減小。其原因可能是，乙醇溶液濃度低時，竹葉中醇溶性黃酮分子未被充分提取，故隨著乙醇濃度增加所得黃酮得率上升。

2.1.2 料液比對黃酮得率的影響

料液比對黃酮得率的影響結(jié)果見表3。當料液比較低時，物料內(nèi)的黃酮無法被溶劑完全提取，而料液比較高時，雜質(zhì)含量也會提高，提取劑又不能得到最有效的利用，所以選擇適當?shù)牧弦罕葘?jié)約資源具有重要意義。由表3可知，當料液比為35∶1時，黃酮得率最大(1.76％)；繼續(xù)增大料液比，黃酮得率卻不再繼續(xù)增加。

表2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響(n＝5)Table 2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of flavonoids(n=5) ％

表3 料液比對黃酮提取率的影響(n＝5)Table 3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids(n=5) ％

2.1.3 提取次數(shù)對黃酮得率的影響

提取次數(shù)對黃酮得率的影響結(jié)果見表4。在溶液中提取黃酮時，有時需要兩次或多次提取才能達到較好的提取效果。由表4可知，提取3次和提取2次的黃酮得率基本不變，說明提取2次時已經(jīng)達到較好的效果了。這是由于提取1次時，黃酮分子在提取液中基本達到飽和，此時物料與溶液中的黃酮分子達到擴散平衡，物料中的剩余黃酮分子無法被提取完全，故需要提取2次甚至多次。

表4 提取次數(shù)對黃酮提取率的影響(n＝5)Table 4 Effect of extraction times on extraction rate of flavonoids(n=5)

2.1.4 提取時間對黃酮得率的影響

若提取時間不夠，則黃酮可能未被完全浸出。提取時間對黃酮得率的影響結(jié)果見表5。由表5可知，提取時間對黃酮提取率的影響不大。當提取時間為1.5h時，提取率為1.54％；繼續(xù)延長提取時間，黃酮得率略有下降；但總體結(jié)果顯示，提取時間對黃酮得率的影響不明顯。其原因可能是，當固液比較大時，固液接觸面的黃酮濃度差大，根據(jù)擴散原理，黃酮分子擴散的推動力大，擴散速率快，提取時間則縮短。

表5 提取時間對黃酮提取率的影響(n＝5)Table 5 Effect of extracting time on extraction rate of flavonoids(n=5)

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

表6為正交試驗結(jié)果。

表6 正交試驗結(jié)果?Table 6 Result of the orthogonal test

從表6中的極差分析結(jié)果可以看出：各因素對黃酮提取率的影響有差異，因素A對總黃酮提取率的影響最大，其次為因素C，因素B和D的影響程度基本相同。對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表7。

從表7的方差分析結(jié)果中可以看出，在影響竹葉黃酮提取率的各因素中，因素A具有顯著性(F＞F0.05)，因素B、C和D無顯著意義(F＜F0.05)。綜合考慮單因素的試驗效果、方差分析的顯著性水平與實際生產(chǎn)時的能源優(yōu)化，可以得出，提取長沙青皮竹葉中黃酮的最優(yōu)工藝條件組合為A3B2C1D1，即70％乙醇，按1∶25(g∶mL)的固液比提取3次，每次提取時間為1.5h。在此工藝條件下，平行試驗5次，長沙青皮竹葉黃酮的得率為1.85％。

表7 方差分析結(jié)果?Table 7 Result of variance analysis

2.3 6種竹葉中黃酮含量的比較分析

根據(jù)正交優(yōu)化結(jié)果，采用優(yōu)化了的工藝條件，對長沙青皮竹、毛竹、假毛竹、斑竹、水竹和琴絲竹6種竹竹葉中的黃酮類化合物進行了提取，并測定了所得黃酮的濃度，計算了竹葉中的黃酮含量，并進行了比較分析。每種竹葉平行測定5次，取其平均值，測定結(jié)果見表8。由表8可知，在該工藝條件下所得長沙青皮竹葉的黃酮含量比其他5種竹葉中的黃酮含量要高，說明長沙青皮竹是一種可用以開發(fā)竹葉黃酮類產(chǎn)品的潛在原材料。

表8 6種竹葉中的黃酮含量(n＝5)Table 8 Flavonoids content in leaves of six bamboo species(n=5)

3 結(jié) 論

文中以黃酮得率為考察指標，通過考察乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時間和固液比例等因素對黃酮得率的影響情況，在單因素試驗的基礎上，設計了四因素三水平的正交優(yōu)化試驗，最后得到的最佳提取工藝條件為：乙醇的體積分數(shù)為70％，固液比為1∶25，提取3次，每次提取時間為1.5h，在此條件下黃酮的得率為1.85％。各因素對提取率的影響程度的大小順序為：乙醇濃度＞提取次數(shù)＞提取時間≈固液比例。

在上述最佳提取工藝條件下，對6種竹葉中的黃酮進行了提取，測定了其黃酮含量。結(jié)果顯示，6種竹葉中的黃酮含量為9.1～18.5mg?g-1。長沙青皮竹竹葉的黃酮含量比同時間同地點采摘的毛竹、假毛竹、斑竹、琴絲竹和水竹都要高，比文獻[21]中報道的其他竹葉的黃酮含量也要高，說明長沙青皮竹葉作為竹葉黃酮的生產(chǎn)原料具有一定的開發(fā)價值。

本試驗采用硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法，利用紫外分光廣度法在510nm處測定吸光度以確定黃酮含量，其含量與用高效液相色譜法測定的結(jié)果具有一定的偏差[22]，偏差主要來自非黃酮類物質(zhì)的顯色，但對于酚酸類含量較少的竹葉提取物來說，也不失為一種簡單、快捷的黃酮含量的測定方法，這種測定方法適用于工業(yè)生產(chǎn)之中[23]。

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