張美杰，李軍林，楊 星，高曉彩，2

(1．西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/人口與健康研究所，陜西西安 710069;2．西北大學(xué)公共管理學(xué)院/應(yīng)用心理學(xué)研究所，陜西西安 710127)

基因突變與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，有時(shí)僅有1個(gè)堿基的改變就會(huì)造成機(jī)體患病甚至死亡，因此搜尋基因突變成為許多疾病研究的切入點(diǎn)。聚合酶鏈反應(yīng)－單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)是 1989年 Orita等人提出的［1］，由于SSCP分析可以檢測(cè)各種點(diǎn)突變，短核苷酸序列的插入或缺失，所以該方法在篩選基因突變時(shí)被廣泛采用。雖然PCR-SSCP技術(shù)被用于基因突變篩選領(lǐng)域，并且正在發(fā)揮著巨大的作用，但是不同研究小組關(guān)于PCR產(chǎn)物的變性方法、是否在膠中加甘油以及凝膠中丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例等細(xì)節(jié)的操作都存在很大的差異，不同的核酸序列可能需要不同的凝膠條件［2］，此外該方法還受其他多個(gè)因素的影響，所以，PCRSSCP技術(shù)的條件不易獲得［3］，因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要不斷的摸索［4］。

為了解決上述PCR-SSCP技術(shù)問(wèn)題，本研究以我們實(shí)驗(yàn)室在使用這一方法進(jìn)行秦巴山區(qū)精神發(fā)育遲滯患者(Mental Rrtardation，MR)相關(guān)基因突變檢測(cè)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)［5－6］，擬利用人類(lèi)GABBR2基因天然存在的rs282129位點(diǎn)(該位點(diǎn)是一個(gè)T/C二態(tài)位點(diǎn)，T到C的顛換可導(dǎo)致編碼蛋白Met轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)hr［7］)為基因突變位點(diǎn)，并以人血液DNA為實(shí)驗(yàn)材料，依次采用不同的變性劑、甘油、交聯(lián)度、TBE緩沖液和電泳時(shí)間等來(lái)摸索PCR-SSCP技術(shù)。希望能找到最佳的PCR-SSCP條件，讓該技術(shù)操作變得更為簡(jiǎn)便，更適合一般實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。進(jìn)而使PCR-SSCP技術(shù)為治療人類(lèi)疾病提供更好的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

在西安市某高校隨機(jī)選取10名18～22歲漢族健康大學(xué)新生為研究對(duì)象。本研究獲國(guó)家人類(lèi)基因組中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有被試者均自愿參與并已簽署知情同意書(shū)。采集參加者的口腔黏膜細(xì)胞樣品，并對(duì)個(gè)人信息嚴(yán)格保密。

1．2 主要試劑

口腔拭子基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司;2×Taq PCR Mix購(gòu)自西安潤(rùn)德生物技術(shù)有限公司;引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA的提取 按照口腔拭子基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取全基因組DNA，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì) NCBI上查找GABRR2基因rs282129位點(diǎn)及其上下游序列，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，并在NCBI上使用Primer-Blast對(duì)引物特異性進(jìn)行比較。引物序列如表1所示，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 GABRR2基因rs282129位點(diǎn)的引物序列以及其他信息Tab．1 The primers’sequences of rs282129 in GABRR2 gene and other information

1.3.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系:總體積10 μL，2 ×Taq PCR Mix 5 μL，25 μmol/L 引物 0.4 μL，DNA 模板 0.4 μL，加 ddH2O 補(bǔ)足 10μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，72℃ 45 s，共33個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，4℃保存。

1.3.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè) PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠(含Goldview染料)檢測(cè)，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增效果，并根據(jù)Maker條帶判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目標(biāo)片段。

1.3.5 SSCP分析 取 PCR產(chǎn)物2μL，與8μL變性劑和2μL 6×Loading buffer混合，98℃變性10 min，立即轉(zhuǎn)置冰上冷卻30 min，加入非變性聚丙烯酰胺凝膠，4℃條件下電泳后銀染顯色，判定帶型。

1.3.6 PCR-SSCP條件摸索 凝膠濃度的選擇由PCR擴(kuò)增片段大小而定，該實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的DNA片段在300～400 bp之間，根據(jù)前人經(jīng)驗(yàn)選擇14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠。先選擇3種變性劑(堿性、中性、低離子濃度變性劑)進(jìn)行優(yōu)化，選出適合的變性劑后依次對(duì)加不加甘油、交聯(lián)度(丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺的質(zhì)量比為29∶1或49∶1)、電泳緩沖液(0.5×TBE或1×TBE)和電泳時(shí)間(3 h 300 V+14 h 180 V或12 h 300 V)等因素進(jìn)行摸索，最后確定出最優(yōu)SSCP條件。具體實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)表2所示。

表2 PCR-SSCP技術(shù)的摸索流程Tab．2 Fumble process of the PCR-SSCP technique

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

用以上引物對(duì)rs282129位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到322 bp DNA產(chǎn)物，沒(méi)有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增等雜帶，宜用于SSCP檢測(cè)(見(jiàn)圖1所示)。

M為DL2000 DNA Marker;1－5為不同樣品的PCR產(chǎn)物圖1 rs282129位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig．1 Agarose gel electrophoresis figure of rs282129’s PCR product

2.2 SSCP技術(shù)的摸索

rs282129位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物依次按照表2中不同的變性劑、甘油、交聯(lián)度、電泳緩沖液和電泳時(shí)間等因素進(jìn)行SSCP條件的優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果如下:

2.2.1 變性劑 在堿性、中性、低離子濃度變性劑的摸索過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，堿性和中性變性劑條帶的分辨率比低離子變性劑帶型分辨率高，而且堿性變性劑變性的DNA量要比中性的多。因此選取堿性變性劑對(duì)后續(xù)條件進(jìn)行摸索(見(jiàn)圖2A－C所示)。

2.2．2 甘油對(duì)凝膠的影響 甘油具有保濕和弱變性劑的作用，對(duì)單鏈DNA在凝膠中的泳動(dòng)速度及提高條帶的分辨率可能產(chǎn)生影響。結(jié)合文獻(xiàn)．［8］，設(shè)定甘油的體積分?jǐn)?shù)為5%，以空白作對(duì)照，比較條帶的分離效果。

本實(shí)驗(yàn)中甘油濃度對(duì)單鏈的遷移速度影響大。在凝膠中加入5%的甘油后，單鏈泳動(dòng)速度較一致，單鏈緊密排列在一起，不易判型(見(jiàn)圖2D所示);而凝膠中不加甘油時(shí)，DNA單鏈泳動(dòng)速度差異大，單鏈條帶相距遠(yuǎn)，易判型(見(jiàn)圖2E所示)。

2.2.3 交聯(lián)度 當(dāng)交聯(lián)度為29∶1與49∶1的SSCP圖譜相比時(shí)，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)度為29∶1的條帶清晰，分離效果好、分辨率高，表明高交聯(lián)度有可能會(huì)抑制某些SSCP條帶的分離(見(jiàn)圖2E、圖2F所示)。

2.2.4 TBE電泳緩沖液 實(shí)驗(yàn)證明，1×TBE電泳緩沖液產(chǎn)生的條帶模糊，分辨率低(見(jiàn)圖2G所示)。0.5×TBE電泳緩沖液條帶清晰，分辨率高(見(jiàn)圖2F所示)。

2.2.5 電泳時(shí)間 300 V 12 h的長(zhǎng)時(shí)間高壓電泳條帶模糊，分辨率低(見(jiàn)圖2H所示)。而4 h 300 V后14 h 180 V的長(zhǎng)時(shí)間低電壓條帶清楚，分辨率高(見(jiàn)圖2F所示)。

圖2 PCR-SSCP的摸索結(jié)果Fig．2 Grope result of PCR-SSCP

3 討論

3.1 變性劑對(duì)SSCP的影響

為了提高DNA變性的效果，往往需要添加化學(xué)變性劑。Maruya等人［9］認(rèn)為用低離子濃度蔗糖變性劑時(shí)，可使PCR產(chǎn)物變性更充分、徹底，單鏈更清晰。本實(shí)驗(yàn)與Maraya等人的結(jié)果部分一致，雖然低離子變性劑使雙鏈變性量增多，可是條帶遷移率變慢。這樣就嚴(yán)重影響了帶型的分辨率，因此認(rèn)為低離子濃度蔗糖變性劑不適合SSCP分析。并且本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)堿性變性劑比中性變性劑條件下的條帶更清楚，可能是堿性條件下DNA片段單鏈更易形成穩(wěn)定的空間構(gòu)象。

3.2 交聯(lián)度對(duì)SSCP圖譜的影響

凝膠交聯(lián)度對(duì)單鏈DNA的構(gòu)象影響較大。如果比例差異大，常會(huì)使單鏈DNA在凝膠中形成穩(wěn)定構(gòu)象或不穩(wěn)定的亞構(gòu)象狀態(tài)［10］。有人認(rèn)為49∶1交聯(lián)度的電泳速度較快，條帶分離效果較好，表明高交聯(lián)度有可能會(huì)促進(jìn)某些SSCP條帶的分離［11］。但本研究發(fā)現(xiàn)，29∶1 與 49∶1 交聯(lián)度最明顯差別是前者分離物的帶型清晰，條帶分辨率高，表明高交聯(lián)度有可能會(huì)抑制某些SSCP條帶的分離。這說(shuō)明交聯(lián)度的選擇可能要根據(jù)不同的基因片段來(lái)調(diào)整，不能一概而論。

3．3 甘油對(duì)SSCP圖譜的影響

甘油是一種弱變性劑，可與硼酸離子發(fā)生反應(yīng)生成酸性復(fù)合物而降低緩沖液的pH值。甘油對(duì)SSCP條帶泳動(dòng)的影響較為復(fù)雜，凝膠中是否添加甘油對(duì)不同基因片段的PCR-SSCP分析有不同的效果。如有文獻(xiàn)報(bào)道，在非變性的聚丙烯酰胺中加入甘油，可增加 SSCP分析中的單鏈DNA條帶的清晰度進(jìn)而提高SSCP檢測(cè)的靈敏度［12－13］，還有人發(fā)現(xiàn)在凝膠中添加甘油后單鏈DNA泳動(dòng)差異縮小，條帶難以分辨，降低了SSCP分析的靈敏度［14－15］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)甘油對(duì)單鏈的遷移速度影響較大，無(wú)甘油時(shí)條帶清晰，相距較遠(yuǎn)，易分辨，而加入甘油后，單鏈排列緊密，多態(tài)性較差，很有可能是甘油通過(guò)改變分析片段的單鏈DNA亞穩(wěn)定的構(gòu)象來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

3.4 TBE

電泳緩沖液的離子強(qiáng)度是通過(guò)改變單鏈DNA分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠表現(xiàn)出差異的重要因素。Nakamura等人發(fā)現(xiàn)與0.5×TBE相比，1×TBE對(duì)300 bp左右的DNA片段分型明顯較好，認(rèn)為高離子強(qiáng)度可提高突變檢測(cè)率［16］。但是，魏太云等［11］和余桂紅等［17］則認(rèn)為0.5×TBE的電泳緩沖液有利于SSCP的分析。本研究證實(shí)同等條件下低濃度的電泳緩沖液有利于提高PCR-SSCP的分型圖譜。所以，在PCR-SSCP分析過(guò)程中應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)的具體情況進(jìn)行調(diào)整。

3.5 電壓

我們發(fā)現(xiàn)一段時(shí)間高壓后改為長(zhǎng)時(shí)間的低壓比長(zhǎng)時(shí)間高壓的分型效果好。開(kāi)始的高壓有助于DNA快速浸入膠中，并且還可使它們都處于同一個(gè)水平線上，隨后的長(zhǎng)時(shí)間低電壓可使由于不同構(gòu)象的DNA在膠中有不同的泳動(dòng)速率而把它們分開(kāi)。長(zhǎng)時(shí)間的高壓電泳有可能會(huì)產(chǎn)生熱量，使DNA的單鏈狀態(tài)復(fù)性成原來(lái)的雙鏈狀態(tài)，導(dǎo)致膠中單鏈的亮度大大下降;而且熱量的產(chǎn)生還會(huì)影響單鏈的空間構(gòu)象，從而使單鏈跑出的帶型處于模糊的狀態(tài)［18］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR-SSCP技術(shù)在篩選基因突變過(guò)程中進(jìn)行摸索，結(jié)果表明:用堿性變性劑對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性，凝膠濃度為14%、丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺的交聯(lián)度為29∶1、無(wú)甘油、0.5×TBE的緩沖液進(jìn)行4 h 300 V后14 h 180 V電泳可得到較理想的圖譜?？傊?，PCR-SSCP是一項(xiàng)精確度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單和低成本的技術(shù)［19］。但是，該方法受到多種因素的影響，在操作過(guò)程中如果能?chē)?yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，并且與其他的先進(jìn)分析方法相結(jié)合，該技術(shù)有可能會(huì)成為一種核酸分析的主流方法并會(huì)拓寬到更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。

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