黨悅方，田 嬌，尚 嬌，王啟林，王 慧，黃建新，房敏峰

(西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室，西北大學生命科學學院，陜西西安 710069)

地衣是低等植物的重要類群，是由真菌和藻類聯(lián)合形成的共生復合體。其初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物在抑菌、抗病毒、抗腫瘤方面表現(xiàn)出顯著的活性［1－2］。Saenz 等［3］發(fā)現(xiàn)地衣酸中松蘿酸對革蘭氏菌的抑制活性最強。賀浪沖等［4］用細胞膜色譜法篩選了金刷把中具有細胞毒的活性成分，趙海［5］采用印度墨汁法觀察了黑石耳粗多糖的增強免疫及抗炎作用。陜西太白山盛產(chǎn)多種藥用地衣，其中，金刷把、太白茶、黑石耳及紅石耳在陜西民間藥用廣泛，具有顯著抗氧化或抑制宮頸癌細胞、黑色素瘤細胞和肝癌細胞增殖的作用［6］，但對其抑菌活性的研究尚未見報道，故本文采用7種腸道致病菌對上述4種地衣的不同提取物進行抑制活性篩選，并采用LC-MS分析其抗菌活性成分，為4種地衣的開發(fā)應用提供參考。

1 材料

1．1 藥 材

金刷把、太白茶、黑石耳和紅石耳為地衣類藥材，采自太白山，經(jīng)西北大學王瑪麗教授鑒定，金刷把為松蘿科植物金絲刷Lethariella cladonioides(Nyl．)Krog的干燥枝狀體;太白茶為不完全地衣類植物雪地茶Thamnolia subuliformis(Ehrh．)W．Culb．的干燥枝狀體;黑石耳為皮果衣科植物皮果衣 Dermatocarponminiatum(L．)Mann．的干燥葉狀體;紅石耳為石耳科植物紅腹石耳Umbilicaria hypococcinea(Jatta)Llano的干燥葉狀體。

1.2 菌種

肺炎克雷伯氏菌Keleiboshijun ganran(編號1.1736)、蠟狀芽孢桿菌 Bacillus cereus(編號1.0626)、凝結芽孢桿菌 Bacillus coagulans(編號1.0949)和巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium(編號1.0941)，購于中國科學院微生物研究所菌種保藏中心;大腸桿菌 Escherichia coli(批號20100930)、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(批號20100323)和金黃色葡萄球菌Staphlococcus aureus(批號20100930)，購于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 儀器

Agilent1100系列高效液相色譜－電噴霧離子阱－質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司);Sw-CJ醫(yī)用型潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術公司);KW-I電熱恒溫培養(yǎng)箱(銀川市金屬制品廠);QYC-2101C全溫培養(yǎng)搖床(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);LDZX-408I型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);FA2004電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)。

1.4 藥品與試劑

色譜乙腈，北京科密歐試劑廠;蒸餾水;牛肉膏，瓊脂，蛋白胨等試劑均為分析純。

2 方法

2.1 不同溶劑提取物的制備

取樣品干燥粉末1.0 g，依次加入乙酸乙酯、氯仿、甲醇、蒸餾水4種不同溶劑各100 mL，分別回流提取1 h，蒸干，加相應溶劑溶解，備用。

2.2 培養(yǎng)基制備

鉤取未活化的菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，備用;鉤取生長于斜面培養(yǎng)基上的實驗菌種，接種于已滅菌的牛肉膏蛋白胨混懸液中，制成菌懸液(106～108CFU/mL)，置搖床上培養(yǎng)48 h，備用。

2.3 菌種活化與菌懸液制備

鉤取未活化的菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，備用;鉤取生長于斜面培養(yǎng)基上的實驗菌種，接種于已滅菌的牛肉膏蛋白胨混懸液(無瓊脂)中，制成106～108CFU/mL的菌懸液，置于搖床培養(yǎng)48h備用。

2.4 抑菌活性檢測

采用紙片法測定抑菌圈的大小［7－8］。

2.5 最小抑菌濃度(M IC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

采用二倍稀釋法［7－8］測定4種地衣提取物的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。

2.6 提取物LC-MS分析

2.7 LC-MS條件

流動相:乙腈(0．003%甲酚)∶水(0．001氨水)=80∶20;電噴霧離子源;負離子模式;噴霧電壓:3.5 kV，霧化氣壓力:241.3 kPa;干燥氣流速:0.8 mL/min，干燥氣溫度:350℃;質量掃描范圍:50～1 000 m/z。

2.8 統(tǒng)計學處理

計量資料以ˉx±s表示，兩組間均數(shù)差別比較用T檢驗，測得T值后轉化為P值，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同溶劑提取物抑菌活性比較

3.1.1 不同溶劑提取物的抑菌活性 由表1可見，金刷把、太白茶、黑石耳、紅石耳甲醇提取物抑菌作用顯著，氯仿提取物有一定的抑菌作用，乙酸乙酯提取物和水提物無抑菌活性。

3.1.2 甲醇提取物的抑菌作用 由表2可知，4種地衣甲醇提取物對肺炎克雷伯氏菌和凝結芽孢桿菌的抑制作用均較敏感;而黑石耳甲醇提取物則對蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌抑制作用顯著(P＜0.05)。

表1 4種地衣不同溶劑提取物抑菌活性Tab．1 Antim icrobial activity of the four lichens'different solvent extracts

表2 4種地衣甲醇提取物抑菌作用Tab．2 Antim icrobial activity of the four lichens'M ethanol extractsˉx±s，n=3

3.1.3 甲醇提取物最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC) 表3，4顯示，金刷把甲醇提取物對肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌抑菌(6．30μg/mL)或殺菌能力較強(12．59μg/mL);太白茶甲醇提取物對肺炎克雷伯氏菌和蠟狀芽孢桿菌抑菌(6．28 μg/mL)或殺菌(12．54 μg/mL)作用較強;黑石耳甲醇提取物對7種供試菌均較敏感，對凝結芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌或殺菌濃度與紅石耳甲醇提取物相當。

表3 4種地衣甲醇提取物的M IC值Tab．3 The four lichens'methanol extracts of M IC value μg/m L

表4 4種地衣甲醇提取物的MBC值Tab．4 The four lichens'methanol extracts of MBC value μg/m L

3.2 甲醇提取物LC-MS圖譜

對4種地衣甲醇提取物進行LC-MS分析，結果如圖1、圖2所示。

圖1 金刷把甲醇提取物的HPLC圖Fig．1 HPLC Chromatogram of Lethariella cladonioidesmethanol extracts

圖2 金刷把松蘿酸的一級質譜圖Fig．2 Primarymass spectrogram of Lethariella cladonioides usnic acid

LC-MS分析結果表明，金刷把4個主要碎片峰(m/z)為:375.069 6［M］－，176.992 3［M －H2O －H］－，343.044 8［M －H］－，339.195 4［M－H2O －H］－，結合文獻［9－10］，推測其為黑茶漬素(C19H18O8，374.475 6)、赤星衣酸(C9H8O6，212.219 8)、松蘿酸(C18H16O7，344.442 6)和維壬烯酸(C18H14O8，358.426 2);太白茶3個主要成分 m/z依次為:373.053 6，345.059 6，359.074 5，其間相差2 個—CH2—和1 個—CH2—，推測［9－10］其為黑茶漬素(C19H18O8，374.475 6)、松蘿酸(C18H16O7，344.442 6)、維 壬 烯 酸 (C18H14O8，358.426 2);黑石耳的2個主要成分 m/z為339.196 3，279.199 3，其中 m/z 339.196 3 與維壬烯酸(m/z358.426 2)之間相差1個H2O，可能是維壬烯酸脫水后的酚酸類成分，暫定為黑石耳酸，而 m/z 279.199 3與前者相差 1個CH2COOH，可能是其分解產(chǎn)物;紅石耳甲醇提取物碎片峰依次為:315.217 7，375.069 0 ，343.044 9，339.195 2，推測紅石耳含有茶漬酸(C16H14O7，336.406 4)、黑茶漬素(C19H18O8，374.475 6)、松蘿酸 (C18H16O7，344.442 6)和維壬烯酸(C18H14O8，358.426 2)類成分［8－10］及維壬烯酸(C18H14O8，358.426 2)類成分［9－10］。

4 討論

1)學者們從地衣體中分離得到了很多具有抗菌活性的化合物，其中尤以地衣酚型縮酚酸類、縮酚酸環(huán)醚類和松蘿酸活性最為顯著。松蘿酸對很多格蘭氏陽性菌和分枝桿菌均有較強抑制作用，它們不但對真菌具有較強的抑制作用，還對很多其他微生物表現(xiàn)出較好活性，由此導致了盤尼西林(penicillins)的發(fā)現(xiàn)［11］。本文涉及的4種地衣抑菌成分均為地衣酸類成分，尤其金刷把中的松蘿酸對大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌有明顯的抑制效果。

2)地衣中的地衣酸不僅有較好的抑菌作用，而且也有明顯的抗腫瘤活性。松蘿酸及其鈉鹽具有體外抗多種肺癌細胞株和乳腺癌細胞株活性［12］，孫艷等［13］發(fā)現(xiàn)地衣酸對前列腺癌細胞具有抑制效應，但對正常細胞不造成傷害。賀浪沖等［4］采用CMC模型，從金刷把中分離得到的醚提成分G，具有一定抑制殺傷Hela細胞作用。但是，松蘿酸的抗癌作用要達到臨床要求還有很多問題需要解決［14］。

3)地衣在自然界生長極為緩慢，野生資源量非常有限，因此，加強野生地衣資源保護以及開展地衣人工培養(yǎng)，就成為我們面臨的迫切任務。雖然地衣中藻類合成的地衣多糖被共生真菌利用，已得到同位素標記證實，而且來自不同共生藻的不同糖類在地衣體內的轉移途徑和速度的研究也取得了明顯進展［15－16］，但要解決地衣的人工培養(yǎng)和提高生長速度，還需要更深入的研究。

4)由于地衣對大氣污染極為敏感，尤其是對空氣中的SO2特別敏感，因此現(xiàn)在國際上專門有一個研究領域叫做“地衣與空氣污染”［16］，然而我國對這方面的研究還很少，利用地衣監(jiān)測空氣污染和評價大氣質量是一個值得探索的領域。

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