黃誠(chéng)胤，潘建華，李國(guó)泰

（重慶大學(xué) 體育學(xué)院，重慶400044）

疲勞對(duì)大腦功能的影響是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前大量研究證實(shí)，當(dāng)人或動(dòng)物處于疲勞狀態(tài)時(shí)，其大腦學(xué)習(xí)、記憶功能可受到明顯的影響［1，2］。研究表明茶葉中含有的兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫活性等作用［3，4］。同時(shí) EGCG還是重要的天然抗氧化劑，它能透過(guò)血腦屏障，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受運(yùn)動(dòng)后代謝產(chǎn)物的影響，具有改善疲勞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的疲勞動(dòng)物模型，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和對(duì)新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)，探索EGCG對(duì)疲勞大鼠的空間學(xué)習(xí)能力與新事物探究能力的影響；采用PCR和Western blot分析了正常組、疲勞組及EGCG防護(hù)組，大鼠海馬NMDA受體中NR1mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的表達(dá)情況，探討了EGCG對(duì)海馬NMDA受體表達(dá)水平的影響以及與空間學(xué)習(xí)能力和新事物探究能力之間的關(guān)系，為日后研究EGCG改善大鼠對(duì)新事物探究能力和空間學(xué)習(xí)能力的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模及分組

1.1.1 動(dòng)物飼養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)選取45只，SPF級(jí)健康SD雄性大鼠，體重（160±20）g左右，動(dòng)物由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK（渝）2007-0003）。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組（n＝15），4～5只／籠飼養(yǎng)。

1.1.2 動(dòng)物分組及模型建立 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（A組）不施加游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，飼養(yǎng)條件與疲勞模型組（B組）和EGCG防護(hù)組（C組）相同。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，對(duì)疲勞模型組（B組）和EGCG防護(hù)組（C組）動(dòng)物進(jìn)行3 d適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，每天1次，每次20 min。游泳訓(xùn)練在直徑120 cm，寬50 cm，水深30 cm的容器中進(jìn)行，水溫（25±2）℃。疲勞模型采用無(wú)負(fù)重的游泳方式建立，當(dāng)動(dòng)物游至從身體輕度下沉，水淹到耳上、過(guò)眼、鼻尖，身體下沉無(wú)力，到連續(xù)3次沒(méi)入水底，每次超過(guò)10 s視為力竭。出水后呼吸幅度深急、反應(yīng)遲鈍、俯臥或端坐，被握持時(shí)，四肢下垂。第一周每日游泳至力竭1次，第二周每日游泳至力竭2次，次間隔≥3 h［5］。EGCG保護(hù)組（C組）訓(xùn)練方案與疲勞模型組（B組）相同。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 給藥方法 EGCG防護(hù)組（C組）按 EGCG 50 mg／（kg·d）容量灌胃，疲勞模型組（B組）與正常對(duì)照組（A組）按1 ml／（kg·d）生理鹽水灌胃。每日在大鼠游泳后30 min給藥，持續(xù)兩周。

1.2.2 通過(guò)探索偏向?qū)嶒?yàn)新事物識(shí)別模型［6］讓SD大鼠在長(zhǎng)方形木箱（105 cm×75cm×30 cm）中適應(yīng)性飼養(yǎng)2～3 d。在箱內(nèi)兩側(cè)各放置一個(gè)物體，并記錄下大鼠分別在不同物體上停留的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)第1天，將大鼠熟悉的物體位置顛換，記錄大鼠在新位置物體上停留時(shí)間及占總時(shí)間的比例，目的是將其結(jié)果作為判斷大鼠對(duì)新事物探究能力的指標(biāo)。

1.2.3 學(xué)習(xí)記憶功能的觀察 Morris水迷宮直徑120 cm，水深30 cm，平臺(tái)高25 cm，平臺(tái)直徑10 cm；水溫（25±2）℃，水中加入適量奶粉使水渾濁。將平臺(tái)置于迷宮某一象限對(duì)角線中點(diǎn)處，在整個(gè)訓(xùn)練過(guò)程中平臺(tái)位置保持不變。將大鼠依次從4個(gè)象限面向池壁放入池中，每次訓(xùn)練搜索時(shí)間60 s，大鼠找到平臺(tái)后使之在平臺(tái)上停留20 s，若未能在60 s找到平臺(tái)則引導(dǎo)其爬上平臺(tái)并停留20 s。每只大鼠每天連續(xù)接受8次定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練3 d。水迷宮訓(xùn)練結(jié)束后B組和C組動(dòng)物開(kāi)始接受兩周疲勞訓(xùn)練。疲勞訓(xùn)練結(jié)束后24 h內(nèi)，重復(fù)進(jìn)行8次定向航行實(shí)驗(yàn)。在此期間正常對(duì)照組（A組）動(dòng)物不接受任何處理，與疲勞模型組（B組）和EGCG防護(hù)組（C組）動(dòng)物同步進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)［7］。

1.2.4 標(biāo)本的采集 采樣前SD大鼠禁食12 h，采用腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉（50 mg／kg體重）麻醉，心臟采血后，采血后立即取出腦組織，分離出海馬，并用滅菌錫泊紙包裹后迅速儲(chǔ)于液氮中。血樣標(biāo)本于室溫靜置2 h后，分離血清（3 000 r／min，離心 10 min），提取上清液與 1.5 ml EP管中分裝標(biāo)記，放置-70℃冰箱中保存。

1.2.5 PCR測(cè)定海馬組織中NMDA受體NR1亞單位表達(dá)稱取100 g海馬組織，提取總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性。采用TakaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)Genbank發(fā)布的NR1 cDNA基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物序列 Sense：5’-AAG GAG TGG AACGGA ATCAT-3’，下游引物序列 Anti-sense：5’-ACT TGA AGGGCT TGG AGA AC-3’，目的片段為 269 bp。內(nèi)參基因GADPH片段大小為450 bp。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性15 s；95℃變性10 s；54℃退火 20 s；68℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。1.2.6 海馬組織中NMDA受體蛋白的表達(dá) 準(zhǔn)確稱取10 g海馬組織，加入含PMSF的裂解液（按照1 ml裂解液加入10 μl PMSF），冰上靜置30 min，用勻漿器研磨組織，整個(gè)過(guò)程需在冰上操作。收集研磨的組織懸液于1.5 ml EP管中離心5 min（12 000 r／min，4℃）后小心吸取上清液。采用 BCA試劑盒（BCA proteinassay reagent kit，美國(guó) Pierce）進(jìn)行蛋白測(cè)定定量。將所需蛋白樣品加入的5×SDS蛋白上樣緩沖液混勻，置于沸水浴中加熱5～8 min，進(jìn)行蛋白變性。以每孔上樣量均為20μg總蛋白上樣后，進(jìn)行SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后用TBST緩沖液清洗2遍，加入封閉液37℃放置1 h。再分別加入單克隆抗體 anti—NR1（1∶100）和內(nèi)參 anti—GADPH（1∶500），放置于4℃冰箱孵育過(guò)夜；以TBST洗膜3次，每次10 min；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（1∶5 000），37℃孵育1 h后，以TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。最后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影試劑盒，顯影，定影，室溫下晾干。將膠片進(jìn)行掃描后用膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量。

1.3 試劑與器材

EGCG標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）；戊巴比妥鈉（成都科龍化工試劑廠）；0.01 mol／L PBS、（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；裂解液 RIPA（Radio-Immunop recip itation Assay，美國(guó)Pierce）；聚丙烯酰胺凝膠（Novex，San Diego，美國(guó) CA）；NMDANR1及GAPDH引物合成（上海 Invitrogen公司）；Trizol試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：北京現(xiàn)代太極電子有限公司；PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間顯著性差異比較采用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和T-test。

2 結(jié)果

2.1 C組疲勞大鼠對(duì)新事物探究能力顯著大于B組

探索偏向?qū)嶒?yàn)反應(yīng)了大鼠在新事物上停留時(shí)間占總體時(shí)間的百分比。實(shí)驗(yàn)對(duì)三組動(dòng)物的探索偏向數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較，三組動(dòng)物探索偏向分別為45%±4%（A組），46%±6%（B組）和43%±1%（C組），三者之間差異有顯著性。在記憶保留過(guò)程中，A組動(dòng)物的探索偏向?yàn)?1%±6%，C組動(dòng)物為56%±4%，B組為40%±3%，C組與B組間具有顯著性差異（P＜0.01），與A組間差異無(wú)顯著性。

2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)中C組動(dòng)物尋找潛伏期顯著短于B組動(dòng)物

尋找潛伏期指動(dòng)物進(jìn)入水迷宮到找到平臺(tái)的這段時(shí)間（用s來(lái)計(jì)算）。實(shí)驗(yàn)對(duì)三組動(dòng)物尋找潛伏期的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)在疲勞訓(xùn)練前三組動(dòng)物尋找潛伏期無(wú)顯著性差異。疲勞訓(xùn)練后第2天，B組和C組動(dòng)物具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Impacts of EGCGon fatigue rats through abilities of learning and memory（s，ˉx±s，n＝8）

2.3 EGCG對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠海馬組織中NMDA受體NR1亞單位表達(dá)的影響

通過(guò)PCR和Western blot測(cè)定NMDA受體NR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。PCR結(jié)果分別成功擴(kuò)增出了269 bp片段的 NR1基因和 450 bp片段的內(nèi)參基因 GADPH。EGCG防護(hù)組（C組）中NR1基因的表達(dá)明顯增加（圖1）。同時(shí)通過(guò)Western blot檢測(cè)到EGCG防護(hù)組（C組）中目的蛋白NR1的表達(dá)也明顯增加（圖2）。

Fig.1 RT-PCR demonstrated the presence of NR1 mRNA

Fig.2 Western blot demonstrated the presence of NR1 protein

3 討論

運(yùn)動(dòng)性疲勞是指在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，機(jī)體的機(jī)能或工作效率不能維持在特定的水平而出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能力和身體功能暫時(shí)下降的現(xiàn)象［8］。隨著競(jìng)技體育水平日益提高，運(yùn)動(dòng)員在訓(xùn)練過(guò)程中承受的心理壓力和運(yùn)動(dòng)負(fù)荷增強(qiáng)，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性疲勞的幾率在逐漸增加。如果運(yùn)動(dòng)性疲勞不能及時(shí)得到恢復(fù)，不僅影響運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)能力，同時(shí)也會(huì)影響其大腦學(xué)習(xí)記憶功能，以及在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的思維和判斷能力。

N-甲基-D-門冬氨酸（NMDA）受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一類重要的興奮性氨基酸受體，屬于離子型谷氨酸受體的一個(gè)亞型，由NR1與NR2亞單位組成。其中NMDA受體通道的必需組成組分是NR1，其表達(dá)量可以間接反應(yīng)NMDA受體的總量。近年來(lái)，大量來(lái)源于生物化學(xué)、電生理和藥理學(xué)等方面多項(xiàng)研究證明，海馬NMDA受體與新事物探究能力和空間學(xué)習(xí)記憶有關(guān)［9］。EGCG是從綠茶中提取出的一種天然的兒茶素類物質(zhì)，它易于通過(guò)血腦屏障達(dá)到腦組織中。有相關(guān)的研究報(bào)道，EGCG在海馬學(xué)習(xí)記憶方面具有一定的功效。在快速老化鼠模型（SAMP 10）中，經(jīng)EGCG處理后可以延緩腦老化、阻止腦萎縮、防止記憶衰退等功能［10］。急性施加EGCG到海馬腦片上可使高頻誘導(dǎo)的LTP幅度明顯增加，而慢性喂食EGCG的大鼠或小鼠可以明顯改善學(xué)習(xí)記憶能力。

為了降低實(shí)驗(yàn)操作本身引起的對(duì)動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力的影響，在這一模型中沒(méi)有任何的規(guī)則，動(dòng)物受到的訓(xùn)練比其他模型少。在疲勞運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前，三組動(dòng)物新事物探究能力無(wú)顯著性差異（數(shù)據(jù)未列出），說(shuō)明三組動(dòng)物對(duì)兩個(gè)物體以及它們所處的位置的選擇能力均衡。接受疲勞訓(xùn)練后，A組動(dòng)物在新事物上停留時(shí)間與總時(shí)間之比為61%，C組動(dòng)物為56%，B組為40%，說(shuō)明在記憶保留過(guò)程中，EGCG可以改善疲勞動(dòng)物對(duì)新事物的選擇能力，幫助它們用較多的時(shí)間去探索新事物。海馬中NMDA受體激活在動(dòng)物對(duì)新事物探究中起著十分重要的作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)NMDA依賴的突觸可塑性可能是主體對(duì)新事物探究的生物學(xué)基礎(chǔ)［11，12］。實(shí)驗(yàn)研究中我們發(fā)現(xiàn)，疲勞訓(xùn)練后B組動(dòng)物海馬NR1 mRNA的表達(dá)與C組相比有顯著性差異（P＜0.05），提示EGCG可以顯著改善疲勞動(dòng)物NR1 mRNA的表達(dá)，提高動(dòng)物對(duì)新事物探究能力。

空間學(xué)習(xí)記憶能力體現(xiàn)動(dòng)物對(duì)整體環(huán)境的記憶，而Morris水迷宮正是利用動(dòng)物的求生本能來(lái)達(dá)到這一目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明未接受疲勞訓(xùn)練前，三組間無(wú)顯著性差異。而接受疲勞訓(xùn)練后C組和B組動(dòng)物與A組相比具有顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明疲勞訓(xùn)練能夠降低動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力；而B(niǎo)組動(dòng)物尋找平臺(tái)的時(shí)間明顯長(zhǎng)于C組動(dòng)物，結(jié)果有顯著性差異（P＜0.01），提示EGCG可在一定程度上改善疲勞帶來(lái)的空間學(xué)習(xí)記憶能力減退，而EGCG可能是通過(guò)調(diào)節(jié)大腦海馬NMDA受體表達(dá)而提高疲勞動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上，疲勞運(yùn)動(dòng)可誘發(fā)大鼠Morris水迷宮中尋找潛伏期的時(shí)間增加，而通過(guò)EGCG保護(hù)后的實(shí)驗(yàn)組可明顯縮短大鼠Morris水迷宮尋找潛伏期的時(shí)間，同時(shí)還可以增加海馬神經(jīng)組織中NMDA受體NR1亞單位的表達(dá)，并有效增強(qiáng)疲勞大鼠對(duì)新事物的探究及空間學(xué)習(xí)能力。

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