陳慧勤，林默君，劉曉如

（1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建泉州362011；2.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，福州350108）

慢性肺源性心臟病（chronic pulmonary heart disease，CPHD）是由肺組織、肺血管或胸廓的慢性病變引起肺組織結(jié)構(gòu)和功能異常，肺血管阻力增加，肺動(dòng)脈壓力增高，使右心室擴(kuò)張、肥厚伴或不伴右心功能衰竭的心臟病。慢性肺源性心臟病80%～90%由慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）引起，是嚴(yán)重危害人體健康的常見病，受到醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。慢性肺源性心臟病發(fā)病過(guò)程中，早期的心肌肥厚可能是心肌細(xì)胞對(duì)外界的刺激的一種適應(yīng)性改變，有一定的代償意義，有利于維持心輸出量，但長(zhǎng)期的心肌肥厚最終會(huì)導(dǎo)致心力衰竭甚至猝死。因此，研究心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制，尋找可行的治療靶點(diǎn)對(duì)治療COPD具有重要意義。

本研究采用慢性低氧模型模擬慢性肺源性心臟病的發(fā)病過(guò)程，慢性低氧造模系統(tǒng)性能穩(wěn)定，根據(jù)低氧箱內(nèi)的氧濃度實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)氮?dú)夤嘧⒌念l率和流量，開關(guān)低氧箱時(shí)，濃度每次都需要重調(diào)，確保氧濃度平穩(wěn)，波動(dòng)不超過(guò)0.2%，可以盡量減少動(dòng)物的死亡率并且保障造模的穩(wěn)定性。慢性低氧使得肺小動(dòng)脈長(zhǎng)期處于收縮狀態(tài)，導(dǎo)致肺循環(huán)阻力增加，形成肺動(dòng)脈高壓，長(zhǎng)期的后負(fù)荷增加便會(huì)造成右心室肥大甚至右心衰竭。

以往的研究發(fā)現(xiàn)Ca2＋信號(hào)在誘導(dǎo)心肌肥大發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用［1］，肥厚心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2＋處于持續(xù)性高水平［2］，且降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，能顯著抑制心肌細(xì)胞肥大［3］。目前的研究表明規(guī)范性瞬時(shí)感受器電位（canonical transient receptor potential，TRPC）亞家族成員與 Ca2＋內(nèi)流有關(guān)，它能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的 Ca2＋濃度，參與細(xì)胞的肥大和凋亡［4］。TRPC亞家族有 7種亞型，分別為 TRPC1-7。TRPC通道可能參與了受體操縱的離子通道（receptor-operated calcium channels，ROCC）、鈣池操縱的離子通道（store-operated calcium channels，SOCC）和牽張激活性離子通道（stretch-activated calcium channels，SACC）。由于以往關(guān)于TRPC亞家族的報(bào)道一般是通過(guò)誘導(dǎo)左心室心肌肥厚大鼠模型來(lái)進(jìn)行研究的，而慢性低氧誘導(dǎo)的右心室心肌肥厚的模型報(bào)道很少，本研究旨在明確慢性低氧誘導(dǎo)的右心室肥厚大鼠模型的心肌細(xì)胞上哪些TRPC亞型介導(dǎo)的Ca2＋內(nèi)流參與了心肌肥厚的發(fā)病，并觀察慢性低氧3周對(duì)左心室功能的影響，從而為臨床治療慢性肺源性心臟病提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1 藥品及儀器

試劑包括：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）、Trizol（invitrogen，美國(guó)）、ROX（Roche，瑞士），引物（生工生物工程有限公司，上海），RIPA（碧云天，江蘇）、PMSF（碧云天，江蘇）、化學(xué)發(fā)光試劑 Novex ECL（Invitrogen，美國(guó)），大鼠抗大鼠β-Actin抗體（Abcam，英國(guó)），兔抗大鼠TRPC1抗體（Abcam，英國(guó)），其余均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器包括：O2濃度分析儀（ProOX-110型，美國(guó)BioSpherix公司）、O2濃度探頭（E702型，美國(guó) Bio Spherix公司）、壓力換能器（YPJ01型，成都儀器廠）、生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（RM6240型，成都儀器廠）、冷凍高速離心機(jī)（Heraeus公司，德國(guó)）、StepOne實(shí)時(shí)PCR儀（ABI公司，美國(guó)）、BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell小型轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad公司，美國(guó)）、Mini-Protean Tetra電泳槽（Bio-Rad公司，美國(guó)）。

1.2 慢性低氧誘導(dǎo)的大鼠模型的建立

健康 SD大鼠，雄性，體重（200±20）g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），共48只，隨機(jī)分成正常對(duì)照組（CON組）和慢性低氧模型組（CH組）（n＝24）。CON組：SD大鼠常壓下飼養(yǎng)3周；CH組：在連續(xù)的常壓低氧箱中飼養(yǎng)3～4周，低氧箱內(nèi)的空氣以氮?dú)夂涂諝饣旌希跃S持氧濃度于10%±0.2%。

1.3 mRVP、mLVP、左／右心室內(nèi)壓變化率（±dp／dtmax）的測(cè)定

CON組和 CH組大鼠分別腹腔注射肝素（heparin，50 IU／100 g），5 min后氨基甲酸乙酯（1 g／kg）腹腔麻醉后，從右頸外靜脈插管直到右心室，記錄大鼠右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）、右心室內(nèi)壓力最大／最小上升速率（right ventricular pressure maximum rate of rise／descent，RV±dp／dtmax）。后從右頸總動(dòng)脈插管直至左心室，記錄左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室內(nèi)壓力最大／最小上升速率（left ventricular pressure maximum rate of rise／descent，LV±dp／dtmax）。

1.4 RVMI、LVMI的測(cè)定

左、右心室插管術(shù)后，迅速開胸取出心臟。沿房室交界處剪去左右心房及大血管，分離右心室（RV）及左心室（LV）、室間隔（S），用濾紙吸去多余水分，分別稱重，計(jì)算 RVMI＝RV／（S）和 LVMI＝LV／（S）。

1.5 心室肌組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

麻醉大鼠開胸后迅速取出心臟，剪除大血管、心包膜、脂肪組織等，濾紙吸干，取左、右心室心肌靠心尖部組織塊，置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色心肌切片，光鏡下觀察心肌病理改變。

1.6 Real-Time PCR檢測(cè) TRPC1／3／4／5／6／7 mRNA表達(dá)水平

將約0.1 g左／右心室組織塊在液氮中充分研磨后，加入TRIzol試劑，提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度及純度。按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR。用β-actin作為內(nèi)參考進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，建立一個(gè)10μl PCR反應(yīng)體系：H2O 4.15μl，ROX 5μl，PCR Forward Primer 0.3μl，PCR Reverse Primer 0.3μl（表 1），cDNA 0.25μl進(jìn)行PCR的擴(kuò)增反應(yīng)：①預(yù)變性 95℃10 min（1 cycle），②變性、退火、延伸 95℃ 30 s，60℃ 1 min（40 cycles）。

Tab.1 mRNA primers ofβ-actin and TRPCsubfamily

1.7 Western blot檢測(cè)TRPC1蛋白表達(dá)水平

左、右心室心肌組織用液氮研磨后，加入RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取40μg總蛋白進(jìn)行 Western blot實(shí)驗(yàn)。12.5%SDSPAGE電泳后行轉(zhuǎn)膜印跡，分別用兔抗大鼠TRPC1抗體或大鼠抗大鼠β-Actin抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)）與膜上的抗原結(jié)合，然后用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）耦聯(lián)的二抗與其反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光試劑Novex ECL（Invitrogen，美國(guó)）檢測(cè)，經(jīng)壓片曝光后顯影和定影。采用Phoretix 1D圖像分析軟件分析各組蛋白表達(dá)情況。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件Origin 6.1對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間均數(shù)比較采用成組 t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 慢性低氧對(duì)大鼠左、右心室血液動(dòng)力學(xué)、肥厚指數(shù)、病理學(xué)表現(xiàn)的影響

2.1.1 左右心室血流動(dòng)力學(xué)和心室肥厚程度比較與正常對(duì)照組（CON組）相比：CH組平均體循環(huán)動(dòng)脈壓（mean systemic arterial pressure，mSAP）無(wú)顯著差異，CH組的RVSP、RVMI顯著升高，右心室內(nèi)壓力最大上升速率（RV＋dp／dtmax）顯著增加，右心室內(nèi)壓力最大下降速率（RV-dp／dtmax）顯著下降（P＜0.01，表2、表3），提示在本實(shí)驗(yàn)條件下慢性低氧3周可成功誘導(dǎo)大鼠形成右心室肥厚，右心室收縮和舒張功能顯著增加；LVSP無(wú)明顯變化，LVMI顯著降低；左心室內(nèi)壓力最大上升速率（LV＋dp／dtmax）和左心室內(nèi)壓力最大下降速率（LV-dp／dtmax）沒(méi)有明顯變化（表3、表4）），表明慢性低氧三周不引起左心室肥厚。以上結(jié)果表明慢性低氧3周能特異性引起SD大鼠右心室肥厚，并增強(qiáng)了右心室心肌收縮和舒張的功能，而對(duì)左心室功能無(wú)顯著影響。

Tab.2 Hemodynamic parameters of right ventricle（ˉx±s，n＝24）

Tab.3 Right／left ventricle hypertrophy index（ˉx±s，n＝24）

2.1.2 病理學(xué)改變 HE染色可見CON組大鼠左、右心室心肌細(xì)胞排列有序，胞核清晰 （圖1A、B）。CH組右心室心肌纖維粗大，細(xì)胞內(nèi)肌原纖維數(shù)量增多，心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞核深染，形狀不整。CH組左心室未發(fā)現(xiàn)明顯變化（圖1C、D，圖1見彩圖頁(yè)Ⅲ）。提示慢性低氧3周能特異性引起右心室增生肥厚，而對(duì)左心室無(wú)顯著影響。

Tab.4 Hemodynamic parameters of left ventricle（ˉx±s，n＝16～18）

2.2 慢性低氧對(duì)右心室心肌組織 TRPC亞家族mRNA表達(dá)的影響

經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT－PCR檢測(cè)，SD大鼠右心室TRPC1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平從 1.00±0.28升高至2.46±1.24（P＜0.05，n＝6），而對(duì)右心室心肌組織其它TRPC亞型的mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著影響（圖2）。

Fig.2 Relative quantification of TRPCs on right ventricular（ˉx±s，n＝6）

2.3 慢性低氧對(duì)右心室心肌組織TRPC1蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)Western blot免疫印跡法對(duì)大鼠右心室心肌組織上TRPC1通道蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析，用βactin對(duì)TRPC1通道蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，CH組SD大鼠右心室TRPC1蛋白相對(duì)表達(dá)水平從1.00±0.62升高至 CH：2.02±0.47（P＜0.05，n＝4），提示了慢性低氧預(yù)處理可以引起大鼠右心室心肌組織的TRPC1蛋白表達(dá)顯著增加（圖3）。

Fig.3 TRPC1 protein expression in right ventricular of CON and CH rats

3 討論

低氧作為一種應(yīng)激的因素，可以對(duì)全身尤其是心血管系統(tǒng)產(chǎn)生顯著影響。慢性低氧一方面可造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，釋放收縮血管的活性物質(zhì)增多，使肺血管收縮，血管阻力增加，形成肺動(dòng)脈高壓。另外低氧增強(qiáng)血管活性物質(zhì)（如內(nèi)皮素-1，5-HT等）的反應(yīng)，呈現(xiàn)慢性痙攣和過(guò)度肌化狀態(tài)，致使肺血管細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)［5］，右心發(fā)揮其代償功能，以克服肺動(dòng)脈壓升高的阻力而發(fā)生右心室肥大。本研究所采用的造模系統(tǒng)性能穩(wěn)定，根據(jù)低氧箱內(nèi)的氧濃度實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)氮?dú)夤嘧⒌念l率和流量。開關(guān)低氧箱時(shí)，濃度每次都需要重調(diào)，確保氧濃度平穩(wěn)，波動(dòng)不超過(guò)0.2%，盡量減少動(dòng)物的死亡率并且保障造模的穩(wěn)定性。

低氧室中飼養(yǎng)大鼠3周，慢性低氧使得大鼠的肺小動(dòng)脈長(zhǎng)期處于收縮狀態(tài)，導(dǎo)致肺動(dòng)脈的收縮力增加，形成肺動(dòng)脈壓力增高，繼而引起心室肌組織代償性肥大，右心室心肌組織切片的病理改變也符合大鼠右心室心肌肥大的結(jié)論。右心室內(nèi)血液動(dòng)力學(xué)改變提示右心室的收縮、舒張功能代償性增強(qiáng)，證明慢性低氧3周大鼠肺動(dòng)脈高壓右心室心肌肥大模型成功建立。同時(shí)，比較慢性低氧3周對(duì)大鼠左心室的影響，結(jié)果提示慢性低氧3周對(duì)大鼠的左心室形態(tài)和功能無(wú)顯著影響。以上結(jié)果證實(shí)：慢性低氧3周誘導(dǎo)大鼠右心室心肌肥大模型成功建立，該造模方法可重復(fù)性較好且對(duì)左心室無(wú)顯著影響，對(duì)于誘導(dǎo)大鼠右心室心肌肥大有特異性。

目前的很多研究都已經(jīng)證實(shí)在大鼠心肌細(xì)胞上能夠檢測(cè)到TRPC亞家族的表達(dá)，這與本研究的結(jié)果一致，其中TRPC1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平在CH組中發(fā)生顯著上調(diào)。TRPC1是TRPC亞家族中第一個(gè)克隆的也是最短的哺乳類 TRP，與果蠅 TRP有40%左右的同源性，廣泛分布于腦、心臟、腎、肺 、骨骼肌、睪丸、卵巢 、唾液腺，少量分布于肝臟和腎上腺［6］。Bush等應(yīng)用腹主動(dòng)脈環(huán)阻法誘發(fā)的心臟肥大的大鼠模型上僅TRPC1表達(dá)上調(diào)。將乳鼠以內(nèi)皮素－1、血管緊張素Ⅱ和苯腎上腺素處理后誘導(dǎo)心肌肥厚模型，其原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞上TRPC1通道上調(diào)，SOCE增強(qiáng)［7］。Seth等用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)，壓力負(fù)荷過(guò)重時(shí)大鼠心肌細(xì)胞TRPCl的表達(dá)上調(diào)，而TRPC1敲除小鼠在壓力負(fù)荷過(guò)重和神經(jīng)激素刺激下，不會(huì)出現(xiàn)心肌肥大［8］。Vindis等發(fā)現(xiàn) 5-HT誘導(dǎo)的大鼠心室肥大的心肌細(xì)胞上TRPC1表達(dá)是上調(diào)的，而 siRNA可下調(diào) TRPC1的表達(dá)并且能抑制NFAT的激活，并能抑制由5-HT受體引起的心肌肥大［9］。

本研究以慢性低氧誘導(dǎo)的大鼠右心室心肌肥厚模型進(jìn)行研究，結(jié)果提示慢性低氧3周可特異性誘導(dǎo)SD大鼠產(chǎn)生右心室心肌肥厚，上調(diào)了編碼右心室心肌細(xì)胞TRPC1通道蛋白的mRNA和蛋白的表達(dá)，提示TRPC1可能參與了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展，TRPC1有可能成為治療肺源性心臟病的新靶點(diǎn)。

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