楊慧娣，楊 錚，劉陶迪

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特010110）

海馬和杏仁核是大腦邊緣系統(tǒng)獨(dú)立的而又相互聯(lián)系的兩個(gè)部位，大腦邊緣系統(tǒng)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)記憶的重要部位。來(lái)自兩個(gè)記憶系統(tǒng)的這兩個(gè)結(jié)構(gòu)可以根據(jù)處理信息的不同，而又存在功能性的區(qū)分。在嚙齒動(dòng)物中，海馬區(qū)是調(diào)節(jié)非自我學(xué)習(xí)的重要腦區(qū)，非自我學(xué)習(xí)與獨(dú)立的線索和位置有關(guān)；而杏仁核是聯(lián)接不同環(huán)境線索和生物刺激（例如食物和損傷等）的重要腦區(qū)［1］。損傷杏仁核或者海馬任意一個(gè)腦區(qū)有時(shí)能增加另外一個(gè)腦區(qū)處理記憶進(jìn)程的能力。這暗示這兩個(gè)腦區(qū)大部分是獨(dú)立的，它們一些重疊的部位具有競(jìng)爭(zhēng)特征。然而，在重疊區(qū)，這兩個(gè)腦區(qū)可能是相互合作的。特別是，增加杏仁核的活性與增強(qiáng)的海馬獨(dú)立調(diào)節(jié)的空間記憶有關(guān)［2］。

伏隔核（nucleus accumbens，NAcc）是邊緣系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)的交互點(diǎn)，伏隔核將動(dòng)機(jī)行為轉(zhuǎn)變?yōu)槟繕?biāo)導(dǎo)向行為。神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)解剖學(xué)的研究已經(jīng)揭示了可能的神經(jīng)機(jī)制，伏隔核及伏隔核內(nèi)的多巴胺神經(jīng)元（dopamine，DA）的分支選擇和整合邊緣和皮質(zhì)的神經(jīng)投射，而這些神經(jīng)可以調(diào)控行為。研究發(fā)現(xiàn)伏隔核的殼通過(guò)空間／背景信息調(diào)控獎(jiǎng)賞和藥物成癮行為。伏隔核的核通過(guò)獨(dú)立的線索調(diào)控各種的行為?；缀说亩喟桶吩谡{(diào)節(jié)學(xué)習(xí)行為方面起到關(guān)鍵作用，然而，大腦邊緣系統(tǒng)中的多巴胺神經(jīng)元是否調(diào)節(jié)與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的行為還不清楚［3］。本研究的目的是測(cè)試大腦邊緣系統(tǒng)的多巴胺神經(jīng)元是否調(diào)控記憶行為。我們假設(shè)多巴胺的激動(dòng)劑阿樸嗎啡能減輕東莨宕堿誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙。本實(shí)驗(yàn)用東莨菪堿誘導(dǎo)小鼠的記憶障礙，為了研究多巴胺神經(jīng)元對(duì)記憶的作用，檢測(cè)腹腔注射多巴胺的激動(dòng)劑阿樸嗎啡后對(duì)小鼠的記憶的影響。我們使用即刻早期基因Fos蛋白標(biāo)記細(xì)胞活性，酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH；多巴胺轉(zhuǎn)化的限速酶）標(biāo)記多巴胺神經(jīng)元，共表達(dá)Fos／TH細(xì)胞表示有活性的多巴胺細(xì)胞，使用免疫組織化學(xué)的方法研究腦組織各區(qū)的多巴胺細(xì)胞的活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)

雄性昆明小鼠，體重20 g，內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)。單籠飼養(yǎng)，飼料為普通飼料，自由攝食飲水。每日更換飲水和飼料，保持動(dòng)物生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度為（22±1）℃，光照時(shí)間為每日 8∶00～20∶00。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

1.2.1 東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶障礙與多巴胺神經(jīng)元的關(guān)系 30只雄性小鼠隨機(jī)分成3組（n＝10），注射生理鹽水組（對(duì)照組：NS組），腹腔注射氫溴酸東莨菪堿溶液 0.3 mg／kg（SCOP 0.3）和 3.0 mg／kg（SCOP 3.0），連續(xù)注射 60 d。注射藥物的第 53天和第60天測(cè)定避暗行為。第60天測(cè)定行為結(jié)束后，將動(dòng)物麻醉后灌注取腦做免疫組化。

1.2.2 多巴胺激動(dòng)劑阿樸嗎啡與東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙 40只雄性小鼠隨機(jī)分成4組（n＝10），腹腔注射東莨菪堿 3.0 mg／kg，連續(xù)注射 60 d。注射藥物的第53天和第60天測(cè)定避暗行為，確定造模成功后，一組注射100μl的生理鹽水（NS），另三組分別注射 100μl的阿樸嗎啡 0.1 mg／kg（APO 0.1）、0.5 mg／kg（APO 0.5）和 2.0 mg／kg（APO 2.0，n＝10）。連續(xù)給藥30 d，在注射阿樸嗎啡第23天和30天測(cè)定記憶行為。第30天行為測(cè)定后將動(dòng)物麻醉后灌注取腦做免疫組化。

1.2.3 小鼠記憶行為檢測(cè) 避暗箱由控制器（明室）和活動(dòng)箱（暗室）兩部分組成，由門洞相連。測(cè)試和記錄小鼠第一次從明室進(jìn)入暗室的潛伏期和受到電擊的錯(cuò)誤次數(shù)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠頭部背對(duì)著洞口放入明室，打開(kāi)門洞，實(shí)驗(yàn)時(shí)間開(kāi)始倒計(jì)時(shí)。若某室的小鼠從明室進(jìn)入暗室中，則潛伏期計(jì)時(shí)停止，同時(shí)在暗室內(nèi)施與36 V的電刺激，此時(shí)所顯示的值即為該小鼠的潛伏期，錯(cuò)誤次數(shù)顯示值為1。小鼠在暗室中受到電擊后逃出，錯(cuò)誤次數(shù)加1。在注射藥物的第53天，對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，記錄小鼠的潛伏期（latency）和 5 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)（number of mistaken），并在7 d后（即第60天）進(jìn)行測(cè)試，同樣記錄小鼠的潛伏期和5 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)。如果5 min時(shí)小鼠仍未進(jìn)入暗室，錯(cuò)誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為300 s。

1.2.4 多巴胺神經(jīng)元 （DA）表達(dá)的檢測(cè)：免疫組織化學(xué)法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10 g／L戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg／kg），經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈勻速灌注 37℃生理鹽水和4%多聚甲醛的磷酸緩沖液（pH 7.2，0.1 mol／L）。將腦移入多聚甲醛中固定4 h。移入含30%蔗糖的磷酸緩沖液中，4℃過(guò)夜。-20℃冰凍連續(xù)切片（冠狀切片），片厚20μm。間隔80μm的切片用以前已經(jīng)建立的方法做c-Fos和TH的免疫組化［1］。簡(jiǎn)短地說(shuō)，切片在 1%硼氫化鈉中孵育 20 min，10%山羊血清1 h。切片在兔抗c-Fos抗體 （c-Fos［4］-G：sc-52；1∶8 000；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）4℃孵育 24 h。之后，切片在生物素化的羊抗兔 IgG（BA-1000；1∶300；Vector，Burlingame，CA）室溫孵育2 h，抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物（Vectastain Elite，Vector，Burlingame，CA）室溫 90 min，DAB（加入鎳粉）顯色。之后，切片在兔抗-TH（AB152；1∶8 000；Chemicon，Temecula，CA）室溫過(guò)夜，切片在生物素化的羊抗兔 IgG（BA-1000；1∶300；Vector，Burlingame，CA）室溫孵育 2 h，抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物 （Vectastain Elite，Vector；Burlingame，CA）室溫90 min，DAB顯色。

1.2.5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每只小鼠各取3張不同斷面切片。并用imagine-pro-plus 6.0分析軟件在各腦區(qū)隨意選取三個(gè)視野，測(cè)量DA陽(yáng)性神經(jīng)元胞體個(gè)數(shù)（反映DA相對(duì)含量）。計(jì)算每組切片單位面積內(nèi)DA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目（平均密度）。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS 17.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在統(tǒng)計(jì)分析前，所有數(shù)據(jù)用Kolmogorov-Smirnov和Levene分別進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；其中實(shí)驗(yàn) 1的 Fos-ir，TH-ir和TH／Fos細(xì)胞的組間差異采用 t檢驗(yàn)。結(jié)果用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 東莨菪堿對(duì)小鼠記憶的影響。

2.1.1 記憶行為 注射東莨菪堿明顯導(dǎo)致小鼠記憶受損。在測(cè)試記憶時(shí)（第 53天），SCOP 0.3、SCOP 3.0組和 NS組潛伏期（P＞0.05）和錯(cuò)誤次數(shù)（P＞0.05）均無(wú)顯著差異；注射的第60天，注射東莨菪堿3.0 mg／kg組（SCOP 3.0）的潛伏期比 NS組顯著縮短，僅是 NS組的 1／4（P＜0.05），東莨菪堿 SCOP 3.0組錯(cuò)誤次數(shù)比 NS組增加了大約 4倍（P＜0.05）。而注射東莨菪堿 SCOP 0.3mg／kg對(duì)小鼠記憶沒(méi)有作用（表1）。

Tab.1 Effect of different dose of scopolamine on dark avoidance behavior in mice（ˉx±s，n＝10）

2.1.2 腦中 Fos-ir和 TH-ir免疫陽(yáng)性反應(yīng) 因?yàn)镾COP 0.3和 NS組記憶沒(méi)有差異，所以我們只將SCOP 3.0組動(dòng)物處死后做腦組織的免疫組化研究。在伏隔核和海馬區(qū)的CA1和CA3的Fos-ir細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01），暗示海馬區(qū) CA1和 CA3區(qū)的活性被抑制。而且與NS組相比，腹側(cè)被蓋區(qū)的TH-ir（P＜0.01）細(xì)胞減少了 38.3%，表明多巴胺神經(jīng)細(xì)胞減少；TH／Fos-ir（P＜0.01）細(xì)胞減少了 48.6%，暗示有功能的多巴胺神經(jīng)元減少。然而，外側(cè)下丘腦的Fos-ir細(xì)胞數(shù)、和室旁核的 TH-ir、TH／Fos-ir細(xì)胞和Fos-ir細(xì)胞均沒(méi)有檢測(cè)到差異（P＞0.05，表 2，圖 1）。

Tab.2 Scopolamine treatment decreased number of Fos-ir，TH-ir and Fos／TH-ir cells compared with saline treatment in mice（ˉx±s，n＝10）

Fig.1 Photomicrographs displaying cells labeled for Fos-ir（blackunctuate nuclear staining）or TH in the NAcc or VTA（A）PVN or LH（B），CA1 and CA3（C）

2.2 多巴胺激動(dòng)劑阿樸嗎啡對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠記憶的影響。

注射阿樸嗎啡明顯減輕了東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶障礙。除了注射0.1 mg／kg對(duì)小鼠的記憶沒(méi)有任何作用外，注射 0.5 mg／kg和 2.0 mg／kg劑量均減輕了東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶障礙（P＜0.05）。與NS組相比，錯(cuò)誤次數(shù)分別減少了65.5%和75.0%；而潛伏期分別增加了1.5倍和1.44倍。且沒(méi)有劑量依賴性（P＞0.05，表 3）。

因?yàn)锳PO 0.5和APO 2.0組沒(méi)有差異所以合并為一組，做免疫組化。注射阿樸嗎啡后，小鼠伏隔核和海馬CA1區(qū)的活性明顯增加，具體表現(xiàn)為與NS組相比，伏隔核的 Fos-ir細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）增加了69.6%，海馬的 CA1區(qū) Fos-ir細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）增加了40.9%；腹側(cè)被蓋區(qū)的TH／Fos-ir共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）比 NS組增加了46.2%，表明有功能的多巴胺神經(jīng)元增加了。同時(shí)，室旁核的Fos-ir、TH-ir和TH／Fos-ir細(xì)胞和外側(cè)下丘腦的Fos-ir細(xì)胞沒(méi)有任何差異（表 4，圖 2）。

Tab.3 Effect of different dose apomorphine on Scopolamine-induced memory deficit in mice（ˉx±s，n＝10）

Tab.4 Apomorphine treatment increased number of Fos-ir，TH-ir and Fos／TH-ir cells compared with saline treatment in scopolamine-induced memory deficit mice（ˉx±s，n＝10）

3 討論

本研究結(jié)果表明東莨菪堿導(dǎo)致小鼠記憶障礙，注射東蒗宕堿的小鼠錯(cuò)誤次數(shù)比對(duì)照組增加了大約4倍，潛伏期的時(shí)間則縮短了大約1／4，伏隔核和海馬區(qū)的CA1和CA3的Fos-ir細(xì)胞數(shù)減少，說(shuō)明海馬區(qū)的東莨菪堿抑制小鼠海馬CA1和CA3區(qū)的活性，與Eldred等的報(bào)道一致［2-4］。同時(shí)，東蒗宕堿導(dǎo)致腹側(cè)被蓋區(qū)的TH-ir和TH／Fos-ir共表達(dá)細(xì)胞顯著減少，暗示多巴胺神經(jīng)元的減少與記憶有關(guān)。注射多巴胺激動(dòng)劑阿樸嗎啡后明顯減輕了東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙，表現(xiàn)為潛伏期增加、錯(cuò)誤次數(shù)減少；伏隔核和海馬CA1區(qū)活性增加，腹側(cè)被蓋區(qū)TH／Fos-ir共表達(dá)的細(xì)胞增多，表明多巴胺神經(jīng)元被激活。這些數(shù)據(jù)表明中腦多巴胺神經(jīng)元與東莨宕堿誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙有關(guān)。

Fig.2 Photomicrographs displaying cells labeled for Fos-ir（blackunctuate nuclear staining）or TH in the NAcc or VTA（A），PVN or LH（B），CA1 and CA3（C）

中腦多巴胺系統(tǒng)控制許多行為［5，6］，例如獎(jiǎng)賞行為、成癮和學(xué)習(xí)行為。研究發(fā)現(xiàn)精神興奮類藥物和大多數(shù)成癮藥物均能增強(qiáng)多巴胺信號(hào)，從而增強(qiáng)調(diào)控學(xué)習(xí)行為的多巴胺進(jìn)程［7］。研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)暴露在精神興奮類藥物，例如氟哌丁苯，會(huì)導(dǎo)致腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺神經(jīng)元的改變和伏隔核多巴胺突觸后膜的變化，這些改變會(huì)持續(xù)幾周或者幾個(gè)月［8，9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙后不僅降低了腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量（TH-ir細(xì)胞數(shù)）和活性（TH／Fos-ir共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)），也降低伏隔核和海馬區(qū)的活性（Fos-ir細(xì)胞數(shù)），暗示多巴胺數(shù)量和活性的減少與小鼠的記憶障礙有密切的關(guān)系。而注射成癮藥物多巴胺激動(dòng)劑阿樸嗎啡后減輕了小鼠的記憶障礙，表現(xiàn)為進(jìn)洞的潛伏期增加、錯(cuò)誤次數(shù)減少。而且注射阿樸嗎啡后盡管沒(méi)有增加多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量，但是腹側(cè)被蓋區(qū)TH／Fos-ir共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯增多，說(shuō)明激活中腦多巴胺神經(jīng)元明顯增加小鼠的記憶。證實(shí)了我們的假設(shè)即多巴胺神經(jīng)元的激活可以增加小鼠的記憶。但是本研究?jī)H僅發(fā)現(xiàn)了中腦多巴胺神經(jīng)元與東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠記憶有關(guān)，還不能直接證明腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺神經(jīng)元直接調(diào)節(jié)小鼠的記憶。因此，下一步的研究將直接損傷腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺神經(jīng)元，驗(yàn)證多巴胺神經(jīng)元調(diào)節(jié)記憶的作用。

總之，本研究證明了多巴胺受體激動(dòng)劑阿樸嗎啡可以緩解東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙。東莨菪堿抑制小鼠海馬CA1和CA3區(qū)的活性。同時(shí)，東莨菪堿不僅導(dǎo)致被蓋腹側(cè)區(qū)的多巴胺神經(jīng)元減少而且也抑制了該區(qū)多巴胺神經(jīng)元的活性。而多巴胺受體激動(dòng)劑阿樸嗎啡則通過(guò)激活海馬CA1區(qū)和伏隔核及腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺神經(jīng)元來(lái)緩解東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙。本研究將進(jìn)一步了解調(diào)節(jié)記憶的機(jī)制，為治療與記憶相關(guān)的疾病探討新的新方法提供理論依據(jù)。

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