涂 悅，楊細(xì)平，商崇智

（1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院，天津300162；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是神經(jīng)外科常見病，是導(dǎo)致創(chuàng)傷患者死亡、殘疾的主要原因之一，病死率高達(dá)30%～50%［1］。目前對(duì)于顱腦損傷的治療包括一般治療、手術(shù)治療、藥物治療、高壓氧治療和亞低溫治療等等。醒腦靜注射液是在安宮牛黃丸的基礎(chǔ)上改制而成的水溶性注射液，廣泛應(yīng)用于臨床腦血管系統(tǒng)疾病的治療中。因?yàn)槭侵兴?，?guó)外對(duì)醒腦靜的研究很少，國(guó)內(nèi)對(duì)醒腦靜的研究主要側(cè)重于醒腦靜注射液對(duì)顱腦損傷患者的促醒作用。而本研究采用Feeney’s自由落體法制備大鼠TBI模型，通過(guò)檢測(cè)其腦內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD））、丙二醛（（malondialdehyde，MDA））含量及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性、腦含水量及S-100B蛋白和神經(jīng)特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）水平，對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分，旨在探討醒腦靜對(duì)顱腦損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材

主要試劑：MDA、SOD、GSH-Px測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），血清S-100B蛋白試劑盒（第四軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室），NSE試劑盒（瑞典Can Ag Diagnostics AB公司），醒腦靜注射液（無(wú)錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司）。儀器：自制自由落體打擊裝置（擊錘、撞桿、打擊支架）；牙科鉆（寧波醫(yī)療器械廠）；S658型號(hào)電熱恒溫水浴箱（溫州永強(qiáng)醫(yī)療器械廠）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DDL-5型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器設(shè)備廠）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年健康清潔級(jí)雄性SD大鼠63只，體重（280～300）g，由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為3組（n＝21）：假手術(shù)組、模型組、醒腦靜組。每組又分3個(gè)亞組（n＝7），每個(gè)亞組，7只用于血清 S-100B蛋白和NSE水平測(cè)定，7只用于神經(jīng)功能評(píng)分及腦含水量測(cè)定，7只用于測(cè)定大鼠血清中SOD、NDA和GSH-Px含量。

1.3 大鼠TBI模型的建立

采用參照 Feeney’s自由落體模型設(shè)計(jì)［2］制作TBI模型。將大鼠用 10%的水合氯醛（0.35 g／kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，俯臥位置于平臺(tái)上，固定頭部。消毒后，沿右側(cè)顱頂旁正中切口，分離骨膜，用牙科鉆在前囪后1.5 mm，中線旁2 mm處鉆一直徑約4 mm的骨窗，保持硬腦膜完整，將撞桿頭端置于骨窗硬膜外，用20 g重的擊錘從30 cm高處自由墜落沖擊撞桿，撞擊能量為0.006 J，造成顱腦損傷，制作大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型。假手術(shù)組僅行開顱術(shù)，不造成腦損傷。醒腦靜組在大鼠顱腦損傷模型制好后10 min內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射醒腦靜注射液 10 ml／（kg·d），模型組與假手術(shù)組則經(jīng)尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液，三組均連續(xù)給藥7 d。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

三組大鼠于給藥第7天進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分量表包括3個(gè)方面，即運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)（提尾時(shí)大鼠前肢屈曲、后肢屈曲、頭部在30 s內(nèi)偏離垂直軸＞100°分別評(píng)為1分；將大鼠放于地板上，大鼠正常行走評(píng)0分，不能直線行走評(píng)1分，向輕癱側(cè)轉(zhuǎn)圈評(píng)2分，向輕癱側(cè)傾倒評(píng)3分）、感覺試驗(yàn)（放置試驗(yàn)1分，本體感覺試驗(yàn)1分，平衡木試驗(yàn)根據(jù)輕重程度分為0-6分）、反射喪失和不正常運(yùn)動(dòng)（耳廓反射，角膜反射，驚恐反射，癲病、肌陣攣、肌張力障礙各占1分），最低為0分，最高為18分，其中0～6分為輕度損害、7～12分為中度損害、13～18分為重度損害。

1.5 腦組織含水量測(cè)定

將大鼠斷頭處死，以損傷灶為中心取出約6 mm3的腦組織，分別置于預(yù)先稱好質(zhì)量的容器內(nèi)，用電子天平稱重。然后放入110℃干燥箱烘烤48 h至恒重，采用同樣方法稱取烘干后腦組織質(zhì)量，根據(jù)干濕質(zhì)量法［3］計(jì)算腦組織含水率，計(jì)算公式：（濕質(zhì)量－干質(zhì)量）／濕質(zhì)量×100%。

1.6 腦組織SOD、MDA和GSH-PX含量的測(cè)定

將大鼠用60 ml預(yù)冷的人工腦脊液（mACSF）快速心臟灌流后斷頭取腦，精確稱重后制備成10%的腦勻漿，4℃ 3 000 r／min離心 10 min后，取上清液-70℃保存用于檢測(cè)標(biāo)本。SOD用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，MDA用硫代巴比妥酸法測(cè)定，GSH-Px活性用比色法測(cè)定，均嚴(yán)格按試劑盒操作程序進(jìn)行。

1.7 血清 S100B蛋白和 NSE水平測(cè)定

將各組斷頭取血3 ml，血標(biāo)本于3 000 r／min離心3 min后，取血清置-20℃冰箱保存，離心后取上清液0.5 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) （ELISA）法檢測(cè)血清中S-100B蛋白和NSE含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量比較

與假手術(shù)組比較，醒腦靜組與模型組有明顯的神經(jīng)缺損，腦組織含水量明顯增加（P＜0.01，表1）；與模型組比較，醒腦靜組神經(jīng)缺損程度及腦含水量明顯低于模型組（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明顱腦損傷可造成大鼠神經(jīng)功能缺損、增加腦含水量，引起腦水腫，醒腦靜治療7 d后可減輕大鼠神經(jīng)功能缺損程度，降低腦含水量。

2.2 顱腦損傷大鼠血清SOD、NDA和GSH-Px比較

與假手術(shù)組比較，醒腦靜組與模型組SOD、GSHPx含量明顯降低，MDA含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，血清中MDA升高水平明顯低于模型組，SOD、GSH-Px降低程度明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01，表 2）。

Tab.1 Changes of neural function score and cerebral water content in rats after traumatic brain injury（ˉx±s，n＝7）

Tab.2 Levels of MDA，SODand GSH-Px in the serum of rats（ˉx±s，n＝7）

2.3 顱腦損傷大鼠腦血清S-100B和NSE比較

與假手術(shù)組比較，醒腦靜組與模型組S-100B蛋白和NSE水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，醒腦靜組NSE蛋白水平明顯降低（P＜0.01，表3）。

Tab.3 Contents of S-100B and NSE in the serum of rats（μg／L，ˉx±s，n＝7）

3 討論

顱腦損傷后會(huì)產(chǎn)生大量自由基，自由基在腦外傷后的繼發(fā)性腦損傷中扮演極其重要的作用，它主要產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細(xì)胞和腦細(xì)胞，損害核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，引起血管源性腦水腫和細(xì)胞死亡。因此增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，有助于預(yù)防繼發(fā)性腦損傷、促進(jìn)受損腦組織康復(fù)［4］。S-100B是一種腦特異性蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌［5］。主要功能包括：（1）在生理濃度下，S-100B具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，高濃度的S-100B具有神經(jīng)毒性作用。（2）能夠營(yíng)養(yǎng)5-羥色胺神經(jīng)元，同時(shí)又受到5-羥色胺負(fù)反饋的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝過(guò)程。（3）參與細(xì)胞內(nèi)外鈣離子水平的調(diào)節(jié)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。（4）增強(qiáng)三磷酸腺苷酶的活性。NSE屬于糖酵解同工酶二聚體，在神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中濃度較高，顱腦損傷時(shí)血清中NSE含量會(huì)升高，目前研究認(rèn)為NSE含量升高的主要原因是損傷導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞膜功能與結(jié)構(gòu)受損，NSE從神經(jīng)元胞漿中釋放出來(lái)，進(jìn)入腦脊液和細(xì)胞間隙中，透過(guò)破損的血腦屏障NSE進(jìn)入血液循環(huán)。因此，血清S-100B和NSE與腦損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［6］，具有較高特異性和敏感性，對(duì)腦損傷的診斷及傷勢(shì)的評(píng)估具有重要的臨床價(jià)值。

醒腦靜注射液是在安宮牛黃丸的基礎(chǔ)上改制而成的水溶性注射液，主要由麝香、石菖蒲、郁金、藿香、冰片等成分組成，具有醒神止痙、活血化瘀、清熱解毒的作用。有研究表明，醒腦靜注射液具有降低毛細(xì)血管通透性、減輕腦水腫、清除自由基等作用，可以在分子水平上進(jìn)行腦保護(hù)［7］。本研究結(jié)果顯示醒腦靜注射液對(duì)顱腦損傷具有保護(hù)作用。研究表明麝香的有效成分是麝香酮，它可以減輕腦缺血大鼠超微結(jié)構(gòu)的損傷和降低神經(jīng)功能缺損程度［8］；石菖蒲提取液可以降低腦損傷大鼠的腦含水量，減輕腦水腫［9］；石菖蒲、冰片合用可以抑制顱腦損傷后腦內(nèi)細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)，減輕腦組織的炎癥反應(yīng)、外傷性腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞缺氧性損傷［10］。

本實(shí)驗(yàn)采用Feeney’s法制作大鼠TBI模型，具有損傷方法簡(jiǎn)便，條件易于控制，損傷程度較一致等特點(diǎn)［11］。通過(guò)測(cè)定醒腦靜組與對(duì)照組腦組織含水量、自由基水平（SOD、NDA和 GSH-Px）及神經(jīng)特異性烯醇化酶（NSE）、S-100B蛋白水平，觀察大鼠神經(jīng)缺損程度來(lái)判定醒腦靜對(duì)顱腦損傷的療效。結(jié)果表明醒腦靜治療7 d后可減輕大鼠神經(jīng)功能缺損程度，減少腦組織含水量，增強(qiáng)SOD和GSH-Px活性，減輕氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物對(duì)神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示醒腦靜注射液對(duì)大鼠顱腦損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減輕顱腦損傷后腦水腫及抑制氧自由基反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞有關(guān)，為臨床用藥提供了理論依據(jù)。

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