韓文志，寧 萌，黃景慧，劉 衛(wèi)，張雁芳，崔文玉，汪 海

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所心血管藥物研究中心，北京100850）

在冷暴露過程中，機(jī)體通過釋放去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、神經(jīng)肽 Y（neuropeptide Y）等血管活性物質(zhì)誘發(fā)體表及肢端血管發(fā)生收縮反應(yīng)，減少外周供血，維持體心溫度［1，2］。此類應(yīng)激反應(yīng)引起的血管收縮及血管內(nèi)皮細(xì)胞冷損傷誘發(fā)形成的血栓是導(dǎo)致外周血液循環(huán)障礙和冷暴露過程中組織壞死的重要原因。因此，研究低溫條件下血管活性變化，改善肢端血液循環(huán)，保護(hù)血管內(nèi)皮避免低溫?fù)p傷對于預(yù)防凍傷發(fā)生、提高人體耐寒能力具有重要意義［3］。

早期研究發(fā)現(xiàn)，妥拉蘇林（tolazoline，Tol）合并山莨菪堿（anisodamine，Ani）能夠發(fā)揮擴(kuò)張末梢血管、改善微循環(huán)的作用，可以顯著提高冷暴露條件下的人體肢端溫度［4］。但由于Tol能夠非特異性阻斷突觸前膜α2受體易引發(fā)心動過速、直立性低血壓等不良反應(yīng)［5］，經(jīng)我室前期對現(xiàn)有臨床常用特異性α1受體阻斷藥進(jìn)行篩選比較，從哌唑嗪（prasozin，PZ）、特拉唑嗪（terazosin）、多沙唑嗪（doxazosin）中選取擴(kuò)血管作用最強(qiáng)的PZ作為替代藥物與Ani聯(lián)合使用，并對其作用效果進(jìn)行了進(jìn)一步的藥效評價(jià)。維生素E（Vitamin E，Vit E）作為氧自由基清除劑可用于對抗低溫誘發(fā)局部組織缺氧引起的血管內(nèi)皮損傷，自身對血管舒縮功能無明顯影響［6］。上述藥物作為臨床用藥已被廣泛使用，但其在低溫條件下血管組織水平的作用特征尚未見報(bào)道，本文通過觀察冷暴露下的血管活性變化及上述藥物在低溫條件下對肢端血管活性的影響，為臨床應(yīng)用口服防凍效應(yīng)藥物提供體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

Vit E、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、苯腎上腺素（phenylephrine，PE）、硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）購自美國 Sigma公司；PZ購自日本 TCI公司。Krebs ringer液（mmol／L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl22.5，KH2P041.2，NaHCO325.0，MgS041.2，EDTA 0.026，Glucose 11.1。

1.2 小鼠尾動脈血管環(huán)的制備

本實(shí)驗(yàn)采用雄性昆明小鼠，體重30～40 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。將小鼠斷頸處死后在鼠尾根部環(huán)切，扯下鼠尾的表面皮膚，分離尾腹側(cè)面動脈血管，置于4℃的Krebs ringer液中，在鏡下小心去除血管周圍粘連的脂肪及結(jié)締組織，剪成約2 mm的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛加有Krebs液的張力測定儀（DMT multi wire myograph system Model 610M）通道浴槽中，浴槽內(nèi)液體溫度依實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行調(diào)整，持續(xù)通入95%O2＋5%CO2的混合氣體，使用 Powerlab生物信號采集分析系統(tǒng)記錄血管張力變化。調(diào)節(jié)血管張力預(yù)負(fù)荷至2 mN，每隔15 min換液1次，平衡1 h后，加入 80 mmol／L KCl收縮血管，重復(fù)三次，激發(fā)血管活性。以 PE（10-6mol／L）收縮血管待張力穩(wěn)定后，累積加入待測藥物記錄血管張力變化情況。

1.3 血管收縮反應(yīng)評價(jià)

選取活性良好的血管環(huán)，經(jīng)KCl預(yù)收縮并洗脫處理，待張力值穩(wěn)定后將其置于設(shè)定溫度條件下。待達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，累積加入 0.1、0.5、1、5、10、50 μmol／L的PE，記錄血管張力變化情況。以血管張力值為縱坐標(biāo)繪制濃度-效應(yīng)曲線。

1.4 血管舒張反應(yīng)評價(jià)

選取活性良好的血管環(huán)，經(jīng)預(yù)處理后置于設(shè)定溫度條件下，待血管張力值穩(wěn)定后加入10-6mol／L PE（PZ組使用 30 mmol／L KCl）收縮血管，分別累積加入不同的擴(kuò)血管藥物，記錄張力變化情況。以PE或KCl誘發(fā)的最大收縮為100%，以加人藥物后的血管張力幅度與PE誘發(fā)最大收縮幅度之間的比值作為舒張率反映血管張力的變化。采用血管舒張率為縱坐標(biāo)繪制濃度-效應(yīng)曲線。

1.5 Vit E低溫條件下對血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的影響

選取活性良好的血管環(huán)，分別加入Vit E至終濃度為 1μmol／L、10μmol／L，并將其置于 8℃低溫條件下孵育。加入PE使血管收縮，待收縮穩(wěn)定后累積加入 ACh（10-10～10-4mol／L），檢測血管對 ACh的舒張反應(yīng)，對比無Vit E添加時(shí)8℃和37℃時(shí)的血管舒張反應(yīng)，評價(jià)血管內(nèi)皮活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同溫度條件下的血管舒縮功能變化特征

苯腎上腺素（phenylephrine，PE）能夠特異性激活α1受體誘發(fā)血管收縮，在不同溫度條件下依濃度梯度累積加入PE，低溫條件下的血管張力變化與37℃時(shí)相比明顯降低（P＜0.01，圖 1A）。37℃、25℃、16℃、8℃下的血管最大收縮張力分別可達(dá)到（30.14±0.68）mN、（20.18±1.39）mN、（16.16±1.00）mN、（9.10±0.32）mN。表明血管收縮具有一定溫度依賴性，隨著溫度的降低，血管收縮減弱。

SNP作為NO供體可以直接作用于血管平滑肌呈濃度依賴地誘發(fā)血管舒張，其作用不經(jīng)過血管內(nèi)皮細(xì)胞。不同溫度條件下經(jīng)相同濃度PE收縮的血管在SNP作用下的血管舒張存在顯著差異（P＜0.01，圖1B）。隨著溫度的降低，SNP作用下的血管最大舒張率增大，量效曲線明顯左移，pD2依次為10.40±0.05、9.70±0.04、8.98±0.09、8.28±0.07。提示隨著溫度的降低，SNP作用下的血管舒張反應(yīng)增強(qiáng)。

2.2 不同溫度條件下 PZ、Ani擴(kuò)血管作用變化特征

PZ為α1受體阻斷劑，能夠引起 KCl（30 mmol／L）預(yù)收縮的小鼠尾動脈環(huán)發(fā)生濃度依賴性舒張反應(yīng)，與37℃條件下時(shí)相比，低溫可明顯提高PZ的擴(kuò)張血管作用（P＜0.01，圖 2A），其中 PZ為 10-11mol／L時(shí)兩組的血管舒張率分別為（5.63±1.26）%和（35.12±3.14）%，PZ濃 度 為 10-5mol／L時(shí) 為（51.37±8.53）% 和（96.48±0.89）%。Ani為阿托品類的生物堿，主要通過阻斷血管平滑肌細(xì)胞上的M1和M3受體發(fā)揮擴(kuò)血管作用，但同時(shí)也有報(bào)道指出其作用具有一定內(nèi)皮依賴性。低溫同樣能夠增強(qiáng)Ani的擴(kuò)血管作用（P＜0.01），其量效曲線存在明顯左移（圖2B），37℃和 8℃時(shí)相比 Emax分別為（74.88±1.76）%、（84.76±1.48）%，pD2分別為 9.77±0.06、9.49±0.06。提示上述兩種藥物在寒冷條件下對于肢端等低體溫部位的血管擴(kuò)張作用更強(qiáng)。

Fig.1 Effects of temperature on the vasoconstriction and vasodilatation in mice caudal arterial rings（ˉx±s，n＝8）

2.3 不同溫度條件下ACh擴(kuò)血管作用變化特征

ACh可誘發(fā)PE預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)發(fā)生濃度依賴性舒張，降低外界溫度可不同程度地抑制血管對 ACh的舒張反應(yīng)。與 37℃組相比，25℃、16℃、8℃下血管舒張 Emax均顯著降低（P＜0.01，圖3），分別為（67.98±0.88）%、（56.73±0.92）%、（46.91±0.80）%、（46.29±0.67）%。結(jié)合 SNP不同溫度條件下的舒血管作用特征，提示低溫條件下ACh舒血管作用的減弱是由于內(nèi)皮細(xì)胞功能受損引起，表明低溫會引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

2.4 低溫條件下Vit E的內(nèi)皮保護(hù)作用

Fig.2 Effects of drugs on the relaxation in different temperature in mice caudal arterial rings（ˉx±s，n＝8）

低溫可造成血管內(nèi)皮細(xì)胞活性降低，致使ACh內(nèi)皮依賴的舒血管反應(yīng)減弱。在Vit E存在的情況下，低溫條件下ACh濃度依賴的舒血管反應(yīng)較對照組出現(xiàn)明顯改善，且10μmol／L的Vit E處理組血管舒張率高于 1μmol／L處理組（P＜0.01，圖 4A），提示Vit E具有一定的內(nèi)皮保護(hù)作用，且此作用在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性。

Fig.3 Effects of acetylcholine on the relaxation in different temperature in mice caudal arterial rings（ˉx±s，n＝8）Ach：Acetylcholine

Fig.4 Effect of the addition of Vit Eduring the cold injury on endothelium-dependent relaxation in mice caudal arterial rings（ˉx±s，n＝8）

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為是對寒冷最敏感的部分，由于血管壁的損傷，血管壁的通透性增強(qiáng)，大量血管內(nèi)液體和蛋白質(zhì)外滲，形成滲出液和組織水腫，血液黏稠度大大增加，血流減慢，血液中有形成分堆積。加之血管壁受損后變粗糙，血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，使膠原纖維暴露，容易使血小板黏著和聚集成為血栓。此外，為維持體心溫度減少外周循環(huán)散熱，機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)促使外周血管收縮，導(dǎo)致外周組織缺氧、酸中毒及血液粘度的改變。該過程又進(jìn)一步誘發(fā)PGF1α、TXA2等細(xì)胞活性物質(zhì)的釋放，加劇血管進(jìn)一步收縮及血栓的形成［7］。當(dāng)機(jī)體無法快速復(fù)溫逆轉(zhuǎn)上述改變時(shí)，會由于炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，加速凍傷發(fā)生發(fā)展過程，最終導(dǎo)致無法逆轉(zhuǎn)的病理性損傷。因此，在短時(shí)間冷暴露情況下通過擴(kuò)張外周血管、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、改善微循環(huán)對于減輕或延緩上述病理過程、減少凍傷發(fā)生有著積極意義。

早期研究發(fā)現(xiàn)，Tol合并Ani在不增加熱債、不降低體心溫度的同時(shí)能夠持續(xù)提高肢端溫度，使肢端免于或延緩凍結(jié)［4］。其中Ani主要通過阻斷血管平滑肌細(xì)胞上的M1和M3受體引起血管舒張，可以明顯、快速緩解內(nèi)臟平滑肌痙攣和血管痙攣，提高細(xì)胞對缺血缺氧的耐受［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫能夠明顯降低血管收縮能力，低溫條件下的血管更易于舒張，提示冷暴露引起的外周血管收縮更易于被藥物所拮抗。PZ、Ani在較低溫度下均表現(xiàn)出優(yōu)于37℃條件下的擴(kuò)血管作用，推測此類藥物作為預(yù)防藥物服用時(shí)對正常體溫下的血液循環(huán)影響較小，當(dāng)體表溫度降低時(shí)能有效擴(kuò)張外周血管，改善微循環(huán)。而PZ作為特異性α1受體阻斷藥用于替代Tol拮抗去甲腎上腺素的縮血管作用，在有效擴(kuò)張外周血管的同時(shí)有利于減少因阻斷α2受體所誘發(fā)的副反應(yīng)。

Vit E是機(jī)體中重要的抗氧化劑，與生物膜中的磷脂有著特殊的親和性，能夠通過抑制活性氧簇離子的形成，預(yù)防或阻止其誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并以此保護(hù)細(xì)胞在低溫條件下免受氧自由基的損傷［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫會引起ACh內(nèi)皮依賴的擴(kuò)血管作用的減弱，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞對血管舒張的調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)一定損傷。使用不同濃度Vit E孵育血管能夠明顯增強(qiáng)低溫條件下血管內(nèi)皮依賴的舒張作用，提示Vit E可以保護(hù)內(nèi)皮避免低溫?fù)p傷，且該作用在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性。Vit E在低溫條件下對血管的內(nèi)皮保護(hù)作用明顯，可適當(dāng)增加Vit E的攝入將有利于減少外周循環(huán)的內(nèi)皮損傷，改善組織供血，減少凍傷發(fā)生。

綜上所述，冷暴露過程中血管舒縮功能和內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用均有改變，血管收縮能力減弱，PZ、Ani此類具有直接平滑肌作用的擴(kuò)血管藥物在低溫條件下的作用效果更強(qiáng)；同時(shí)Vit E在低溫條件下具有良好的內(nèi)皮保護(hù)作用，可以改善ACh內(nèi)皮依賴的擴(kuò)血管作用。外周供血不足和血管內(nèi)皮細(xì)胞受損直接導(dǎo)致了冷損傷的發(fā)生發(fā)展，因此通過擴(kuò)張外周血管、增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)具有積極意義。此外，由于擴(kuò)血管藥物低溫條件下的作用有所增強(qiáng)，也提示其作為預(yù)防藥物出現(xiàn)時(shí)的良好應(yīng)用前景。

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