陳靜，章慧娣，樓威洋，邵蓉蓉，張麗芳，薛向陽，朱小春

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 風濕免疫科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科， 浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035；4.溫州醫(yī)科大學 微生物學與免疫學教研室，浙江 溫州 325035）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及全身多系統(tǒng)、多臟器的自身免疫性疾病[1]，其病因及發(fā)病機制尚未明確。近年來的研究顯示，病毒感染，如EB病毒、細小病毒B19等是SLE發(fā)生發(fā)展的重要促進因素[1]。但人類巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染與SLE的相關性目前仍存在爭議。有研究認為HCMV的感染可能為SLE的一個重要病因，并加重SLE疾病的進程[2]，同時，SLE病情的嚴重也可能導致HCMV的感染[3]，兩者互為因果。但有些研究認為HCMV感染與SLE無關[4]?？紤]到人群高感染率的HCMV具潛伏感染和廣泛細胞親嗜性的特征，不同檢測方法可明顯影響HCMV檢測結果。為此，本研究通過血清HCMV特異性IgG、IgM檢測分析SLE患者及健康體檢者HCMV感染的同時，選擇HCMV必不可少的UL55基因以及潛伏相關的、高度保守的，且只在臨床分離株中存在的UL138基因，建立高度敏感特異的PCR方法，分析SLE患者及健康體檢者外周血白細胞內HCMV感染狀態(tài)，多層面評價HCMV感染與SLE的相關性。

1 材料和方法

1.1 一般資料 本研究共計收集自2011年3月至2012年5月間在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院住院治療的SLE患者抗凝外周靜脈血標本60例，其中男15例，女45例，年齡11～70歲，平均（34.17±12.80）歲。所有SLE患者均進行了常見臨床癥狀調查、常見檢測指標的測定，并根據國際通用的SLE疾病活動指數（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）[5]進行評分，一般認為≤5分為非活動期，＞5分為活動期。另選取同一時期本院健康體檢者（均排除SLE）抗凝外周靜脈血標本111例，其中男41例，女70例，年齡18～55歲，平均（32.68±10.43）歲。兩組人群均排除乙肝、丙肝、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、梅毒、EB病毒（epstein-barr virus EBV）等感染。本研究經本院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑 KOD Plus Neo[東洋紡（上海）生物科技有限公司]；100 bp DNA marker[天根生化科技（北京）有限公司]；DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；紅細胞裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；pEASY-Blunt Zero Cloning Vector[天根生化科技（北京）有限公司]；HCMV IgG檢測試劑（德國羅氏診斷有限公司）；HCMV IgM檢測試劑（德國羅氏診斷有限公司）。引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 外周血白細胞分離：取當天采集的SLE患者及健康體檢者的EDTA抗凝靜脈血（2 mL），4 ℃1 500 r/min離心10 min，吸去上層血漿，向下層的血細胞懸液中加入3倍體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，充分裂解20 min，4 ℃ 3 000 r/min離心20 min，棄上清。用PBS重懸下層的白細胞沉淀4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，棄上清，以便徹底清除紅細胞，重復清洗兩次。

1.3.2 基因組DNA抽提：采用DNA提取試劑盒抽提外周血白細胞的DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA純度。

1.3.3 PCR檢測外周血白細胞中HCMV UL55和UL138基因：采用巢式PCR技術檢測SLE患者及健康體檢者外周血白細胞內HCMV UL55和UL138基因。UL138基因及UL55基因檢測的引物序列[6]及反應條件見表1。第二輪PCR反應體系以1μL第一輪PCR擴增產物為模板進行擴增。陽性對照為確診HCMV感染患者的DNA，陰性對照為滅菌的雙蒸水。UL55及UL138的PCR產物大小分別為100 bp和89 bp。目的條帶連接pEASY-Blunt Zero Cloning Vector，挑陽性克隆測序。

表1 巢式PCR引物及反應條件

1.3.4 血清HCMV特異性IgG和IgM檢測：收集SLE患者及健康體檢者對照血清，按血清HCMV IgG、IgM檢測試劑說明書操作檢測血清中HCMV IgG和IgM（委托某醫(yī)院檢驗科代為檢測）。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數資料用 ±s表示，采用獨立樣本t檢驗進行比較；分類資料用n/%形式表示，采用卡方檢驗及Fisher確切概率法比較不同方法檢驗HCMV感染的相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞內HCMV UL55、UL138 PCR檢測方法的建立 以SLE患者及健康體檢者外周血白細胞中抽提的DNA（濃度測定范圍在408.1～510.6 ng/μL）為模板進行巢式PCR擴增（第1泳道為陽性對照，最后一個泳道為陰性對照），PCR產物瓊脂糖凝膠電泳顯示，分別在100、89 bp位置出現(xiàn)單一的目的條帶（見圖1A-B），分別將其切膠回收后連載體送測序，測序結果與目的序列吻合（見圖1C-D），說明建立的PCR方法可用于檢測外周血白細胞的HCMV感染。

2.2 SLE患者及健康體檢者HCMV感染不同檢測方法陽性率的比較 60例SLE患者及111例健康體檢者外周血白細胞內HCMV UL55、UL138基因檢測及血清HCMV IgG、IgM結果顯示，SLE患者外周血白細胞內HCMV UL55、UL138及血清HCMV IgG、IgM陽性率分別為43.33%、96.67%、100%和6.67%，健康體檢者外周血白細胞內HCMV UL55、UL138及血清HCMV IgG、IgM陽性率分別為1.80%、100%、100%和0.90%。SLE患者與健康體檢者外周血白細胞內HCMV UL138基因及血清HCMV IgG檢測陽性率兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；SLE患者外周血白細胞內HCMV UL55基因檢測陽性率高于健康體檢者（P＜0.01）。

2.3 HCMV不同檢測方法相關性分析 比較外周血白細胞內HCMV UL55、UL138檢測和血清HCMV IgG、IgM檢測結果顯示，細胞內HCMV UL138檢測與血清HCMV IgG檢測存在較好的一致性，兩種方法同時檢測陽性率達98.83%；細胞內HCMV UL55及UL138檢測間一致性較差，兩種檢測同時陽性率僅15.79%（見表2）。

圖1 外周血白細胞HCMV UL55、UL138 PCR檢測及測序結果

表2 HCMV不同檢測方法陽性率的比較

2.4 外周血白細胞內HCMV感染檢測與SLE患者免疫系統(tǒng)相關指標的相關性分析 對外周血白細胞內HCMV UL55檢測結果與SLE患者臨床特征及免疫系統(tǒng)相關指標進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，與外周血白細胞內HCMV UL55陰性的SLE患者相比，細胞內HCMV UL55陽性患者的抗Rib-P抗體（P=0.031）、直接Coomb’s試驗（P=0.017）陽性率明顯升高，血清總IgG（P=0.023）、β2-GP-1（P=0.022）水平明顯升高，抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）、抗ds-DNA抗體、抗U1RNP抗體、抗組蛋白抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體陽性率及SLEDAI評分等指標差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。細胞內HCMV UL138檢測結果與SLE患者免疫系統(tǒng)相關臨床指標差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表3。

表3 不同HCMV感染檢測情況與SLE患者臨床指標的相關性分析（n=60，n/%， ±s）

3 討論

HCMV屬于皰疹病毒β亞科，是一種廣泛細胞親嗜性的DNA病毒，能感染上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、外周血單個核細胞及神經細胞等。人群HCMV感染十分普遍，據報道中國成人感染率高達95%[7]，與本研究結果相符。關于SLE與HCMV感染相關性研究近年來的研究證據表明HCMV的感染是SLE重要促發(fā)因素，并加重SLE疾病的進程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照比較，SLE患者HCMV感染陽性率以及體內HCMV DNA拷貝數明顯升高[8]；大部分的SLE患者血液中存在HCMV PP65 C末端的抗體[9]；此外，核內U1小核糖核蛋白（U1 snRNP）抗體多見于SLE患者以及HCMV感染或免疫接種的動物體內或血液中[10-11]。但James等[4]研究認為HCMV感染與SLE無關。而且SLE患者HCMV感染率不同的報道也存在較大差異：Takizawa等[12]利用PP65抗原檢測風濕病患者中HCMV的感染情況，總共151例患者中有149人感染，其中SLE患者74例全部感染HCMV，感染率達100%；Newkirk等[10]使用ELISA試劑盒檢測HCMV抗體，SLE患者HCMV感染率約為60%，與正常對照組相近；Su等[13]通過對類風濕因子（RF）中和處理后，87個SLE患者中有84例CMV-IgG陽性（陽性率為96.55%），9例CMV-IgM陽性（陽性率為10.34%）。由于HCMV基因組上存在165～252個開放閱讀框（open reading frames，ORF），而且潛伏感染是HCMV重要生物學特征[14-16]，所以選擇不同檢測基因、采用不同檢測手段均可能導致HCMV檢測結果的變化。

目前對于HCMV的檢測方法主要有病毒分離、PP65抗原檢測、血清IgM、IgG抗體檢測、核酸檢測等方法。HCMV診斷的金標準是HCMV分離培養(yǎng)，但是HCMV在體外人成纖維細胞培養(yǎng)中增殖非常緩慢，復制周期為36～48 h。HCMV初次分離培養(yǎng)，需1個多月才出現(xiàn)特殊的細胞，而且操作繁瑣，設備要求高，即使分離結果陰性并不能完全排除HCMV活動性感染，因此不適于作為檢測HCMV感染的常用方法?，F(xiàn)在臨床上HCMV感染的診斷主要依賴于抗體血清學（IgG、IgM）檢測或血清抗原（PP65）檢測。但HCMV感染細胞譜廣泛[17]，血清學診斷難以明確感染部位，且經過激素和/或免疫抑制劑治療后，HCMV感染可能不出現(xiàn)或延遲出現(xiàn)IgM類抗體反應。由于PCR技術敏感性高，已被廣泛應用于HCMV感染檢測?？捎糜赑CR檢測的HCMV靶基因有：pp65基因[18]、UL54[19]、UL83[20]、UL123[21]、US17基因[22]、UL75[23]等。已有文獻報道編碼糖蛋白B（gB）的UL55基因是HCMV一個不可缺少的、高度保守的基因[24]，而UL138是HCMV潛伏感染所必需的高度保守的基因[25]。為更好地反映SLE患者HCMV感染情況，我們不但進行血清HCMV IgG和IgM檢測，而且建立細胞內HCMV UL55及UL138巢式PCR技術以檢測外周血白細胞內HCMV感染。PCR產物電泳及測序結果證實我們建立的巢式PCR能特異性檢測到外周血白細胞內HCMV UL55及UL138基因。

在血清HCMV IgG、IgM及細胞內HCMV UL55、UL138四種不同HCMV檢測方法中，不管是SLE患者還是健康體檢者，血清HCMV IgG及細胞內HCMV UL138基因檢測幾乎全部陽性，細胞內HCMV UL55基因檢測其次，血清HCMV IgM檢測陽性率最低。比較SLE患者與健康體檢者檢測結果，血清HCMV IgG及細胞內HCMV UL138基因檢測結果之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），SLE患者血清HCMV IgM檢測陽性率高于健康體檢者，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.052），SLE患者外周血白細胞內HCMV UL55基因檢測的陽性率顯著高于健康體檢者（P＜0.01）。HCMV感染4種檢測方法的相關分析顯示，細胞內HCMV UL138檢測與血清HCMV IgG檢測存在較好的一致性，而同為細胞內HCMV感染檢測，由于UL55及UL138目的基因選擇不同，HCMV檢測感染陽性率之間存在顯著性差異。這些結果提示，不同檢測基因、不同檢測手段均可能影響HCMV檢測結果。

進一步分析外周血白細胞內HCMV感染檢出情況與SLE患者免疫系統(tǒng)相關指標間的相關性，以細胞內HCMV UL55基因作為HCMV感染指標，HCMV感染與SLE患者多項免疫系統(tǒng)相關指標存在相關性，如抗Rib-P抗體、直接Coomb’s試驗、血清總IgG、β2-GP-1等，但是以細胞內HCMV UL138基因作為HCMV感染指標，HCMV感染與SLE患者免疫相關指標沒有相關性。因此，HCMV感染與SLE存在一定的相關性，但由于本研究僅從HCMV感染的陽性率方面進行評價，并未深入探究SLE患者疾病活動期與緩解期以及其臨床指標與HCMV拷貝數的關系，且樣本量偏少，未進一步研究HCMV活動性感染和潛伏期對SLE患者疾病情況的影響。因此，HCMV感染與SLE之間相互作用的機制有待于進一步探索。

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