張?jiān)?邢 新， 楊 超

綜 述

脂肪來源干細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面的研究進(jìn)展

張?jiān)?邢 新， 楊 超

創(chuàng)面； 脂肪來源干細(xì)胞； 臨床研究

創(chuàng)面修復(fù)是指機(jī)體遭受外力作用后，皮膚肌肉等組織出現(xiàn)離斷或損傷后的修復(fù)過程，其中包括各種組織的再生和肉芽組織增生瘢痕形成等復(fù)雜的病理生理過程。一般的創(chuàng)面通過縫合可促進(jìn)其愈合。而大面積燒傷、擠壓傷、糖尿病患者，因創(chuàng)面損傷大，愈合能力差，往往形成不愈合創(chuàng)面。目前，臨床多采用皮瓣或皮片移植來修復(fù)此類創(chuàng)面，但是存在著供皮區(qū)組織缺損及瘢痕形成等缺點(diǎn)。干細(xì)胞技術(shù)為皮膚組織的修復(fù)提供了新的思路。常用的干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)、人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等。ADSCs是Zuk等[1]從脂肪組織中獲取的一類多能干細(xì)胞。ADSCs具有取材方便、來源充足、容易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，且具有向3個(gè)胚層分化的能力，并可以分泌多種細(xì)胞因子[2]。在創(chuàng)面修復(fù)中，將ADSCs結(jié)合或者不結(jié)合的支架材料植入皮膚缺損處，通過向表皮細(xì)胞分化及細(xì)胞因子作用等來修復(fù)創(chuàng)面。ADSCs與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，甚至表現(xiàn)出更好的創(chuàng)面愈合能力[3]。

1 ADSCs促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制

1.1 旁分泌作用 生長因子或細(xì)胞因子能促進(jìn)相應(yīng)細(xì)胞遷徙、增生、收縮、分化，改善局部組織的微環(huán)境，加快創(chuàng)面的愈合。ADSCs能分泌多種生長因子，調(diào)控周邊的細(xì)胞。

常見的生長因子包括：血小板源性生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等。Lee等[4]將皮膚角質(zhì)細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共同放置于50%ADSCs條件培養(yǎng)基(conditioned medium of ASCs, ASC-CM)中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，ASC-CM上調(diào)了成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白。在體外創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)，ASC-CM提高了角質(zhì)細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的增殖能力，增強(qiáng)了成纖維細(xì)胞收縮能力。Moon等[5]將角質(zhì)細(xì)胞放置于低氧條件下的ASC-CM中培養(yǎng)。通過DNA基因片段的分析，篩濾了290個(gè)發(fā)生2倍以上改變的基因片段，發(fā)現(xiàn)被調(diào)低的基因片段大部分與細(xì)胞黏附相關(guān)，與DNA復(fù)制相關(guān)的片段沒有一個(gè)被調(diào)低，與細(xì)胞周期相關(guān)的基因片段則被大部調(diào)高。角質(zhì)細(xì)胞的增殖、遷徙能力獲得顯著提高。對細(xì)胞因子的分析中，發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子-1(fibroblast growth factor-1, FGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3)、VEGF、白介素6(interleukin-6, IL-6)、集落刺激因子(colony stimulating factor， CSF)含量的提升。Kim等[6]發(fā)現(xiàn)，ADSCs不僅可以通過細(xì)胞間的直接接觸，也可以通過旁分泌作用，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和成纖維細(xì)胞向創(chuàng)面遷徙。ASC-CM通過上調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、纖維連接蛋白和蕭條MMP-1 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，ADSCs能顯著減小創(chuàng)面面積，加速上皮化。

1.2 ADSCs分化為組織細(xì)胞來修復(fù)創(chuàng)面 ADSCs具有多向分化潛能，能分化為組織細(xì)胞來修復(fù)創(chuàng)面。Altman等[7]以絲蛋白-殼聚糖支架種植綠色熒光蛋白-1標(biāo)記的ADSCs后用于鼠類創(chuàng)面，術(shù)后2周實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面部位血管密度較對照組大，成纖維熱休克蛋白、平滑肌肌動(dòng)蛋白和綠色熒光蛋白標(biāo)記物陽性，并可見ADSCs 分化成上皮細(xì)胞。由此可見，ADSCs能分化形成血管、內(nèi)皮、表皮，修復(fù)組織缺損。

1.3 ADSCs促進(jìn)血管長入創(chuàng)面 局部血運(yùn)循環(huán)對于創(chuàng)面愈合非常重要，血液循環(huán)一方面可保證組織再生所需要的氧和營養(yǎng)，另一方面對壞死物質(zhì)的吸收及控制局部感染起著重要作用。ADSCs用于創(chuàng)面修復(fù)能明顯提高創(chuàng)面的新生血管密度[8-15]，其機(jī)制在于ADSCs旁分泌VEGF、bFGF等細(xì)胞因子，促進(jìn)了血管生長。ADSCs能向血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化。Zamora等[9]將ADSCs種植于具有三維結(jié)構(gòu)的聚乙二醇-纖維蛋白凝膠，培養(yǎng)3 d后細(xì)胞開始出現(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)，將其種植于動(dòng)物模型，其內(nèi)可發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞，血管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物vWF呈陽性，表示管狀結(jié)構(gòu)確實(shí)是血管內(nèi)皮。

2 優(yōu)化ADSCs治療創(chuàng)面效果的新技術(shù)

2.1 基因改造技術(shù) 基因強(qiáng)化技術(shù)是利用基因工程技術(shù)將編碼特定功能因子的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)目的產(chǎn)物。目前研究轉(zhuǎn)入的目的基因，大部分是調(diào)控生長因子的基因，通過調(diào)整特定生長因子的分泌水平，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增值、遷徙、分化，加速創(chuàng)面愈合?；驈?qiáng)化技術(shù)目前常用的有特定質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，即通過逆轉(zhuǎn)錄或非逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。

Nauta等[16]使用編碼VEGF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ADSCs，通過在老鼠創(chuàng)傷模型應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，極大地增快了創(chuàng)面的愈合時(shí)間，第8天創(chuàng)面的愈合水平，相當(dāng)于普通ADSCs對照組10～12 d的愈合水平。組織學(xué)檢查顯示，創(chuàng)面纖維蛋白和膠原沉積較對照組增多。Song等[17]通過逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，將MYC基因和AKT基因轉(zhuǎn)染ADSCs，轉(zhuǎn)染MYC后的ADSCs在與血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu)明顯增多，可見VEGF分泌明顯增多，而MYC和AKT共轉(zhuǎn)染的ADSCs在ELISA實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出有更多的VEGF分泌。在動(dòng)物創(chuàng)傷模型中，CA-Akt/v-myc hASCs條件培養(yǎng)基相比普通ASC條件培養(yǎng)基，創(chuàng)面愈合更快。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，CA-Akt/v-myc hASCs炎癥反應(yīng)更小，上皮細(xì)胞和膠原沉積與正常上皮更加接近。

2.2 細(xì)胞膜片技術(shù) 細(xì)胞膜片是近年興起的一種組織工程新技術(shù)，相比種子細(xì)胞，其擁有三維結(jié)構(gòu)，保留了細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)分泌的細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞因子，膜片化后的ADSCs使用更加方便。近年來，Lin等[8]將ADSCs制備成細(xì)胞膜片，嘗試用于創(chuàng)面修復(fù)。在創(chuàng)面愈合的早期，ADSCs膜片創(chuàng)面愈合速度，較直接使用ADSCs的對照組明顯加快。血管密度檢測發(fā)現(xiàn)，ADSCs膜片創(chuàng)面較對照組增加了15%以上。Cerqueira等[18]同樣使用ADSCs膜片來修復(fù)全層皮膚缺損創(chuàng)面。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面愈合速度較不使用膜片的對照組明顯增快。

2.3 缺氧微環(huán)境 脂肪組織處于末梢循環(huán)，往往處于氧飽和度相對較低的微環(huán)境，氧濃度只有約3%。低氧環(huán)境對ADSCs的增殖、分化、黏附、遷移、細(xì)胞反應(yīng)、分泌都有影響[19]。Lee等[20]發(fā)現(xiàn)，低氧(2%)環(huán)境下獲得的ADSC-CM較正常濃度下的CM，更能增強(qiáng)皮膚成纖維細(xì)胞的遷移，加快膠原沉積。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，mRNA和蛋白測量顯示，低氧上調(diào)了VEGF和bFGF表達(dá)，使用低氧環(huán)境下獲得的ADSC-CM能明顯地縮小創(chuàng)面面積。對照試驗(yàn)中，研究者使用抗VEGF和bFGF抗體中和了VEGF和bFGF，這減弱了成纖維細(xì)胞的遷移和創(chuàng)面愈合能力?？梢?，VEGF和bFGF的分泌是影響創(chuàng)面愈合的重要原因之一。

2.4 低能激光 低能激光在臨床中應(yīng)用廣泛，其不僅能止痛，而且能改善微循環(huán)。同時(shí)低能激光能促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖，對間充質(zhì)干細(xì)胞還能增加生長因子分泌與分化。Kim等[21]將低能激光(1 J/cm2)結(jié)合ADSCs修復(fù)創(chuàng)面時(shí)發(fā)現(xiàn)，激光照射減少了細(xì)胞凋亡，從而增加了ADSCs在組織中的成活率，同時(shí)激光還增加了VEGF和bFGF的分泌。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，低能激光結(jié)合ADSCs修復(fù)創(chuàng)面，要優(yōu)于單純干細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面，創(chuàng)面的血管化水平和皮膚附件再生水平均得到了提高。

2.5 支架材料 支架材料為ADSCs提供合適的生存和分化微環(huán)境，合適的生物支架材料能提高創(chuàng)面修復(fù)的效果。Huang等[12]通過對比硅膠和脫細(xì)胞真皮作為支架并結(jié)合ADSCs用于修復(fù)創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)種植于脫細(xì)胞的支架，有更好的愈合效果。Shen等[11]將脂肪細(xì)胞種植在聚乙烯-殼聚糖支架中作為人工真皮用于糖尿病創(chuàng)面的修復(fù)，發(fā)現(xiàn)能有效加速創(chuàng)面愈合。楊超等[22]制作放射性復(fù)合損傷模型。在損傷創(chuàng)面上滴加ADSCs-HA復(fù)合物，結(jié)果顯示，在創(chuàng)面血管新生方面，ADSCs-HA復(fù)合物組新生微血管數(shù)量明顯提高。

隨著電紡絲納米纖維技術(shù)的發(fā)展，越來越多的材料通過電紡絲技術(shù)被用來制成新的細(xì)胞支架。Machula等[23]使用電紡絲彈性蛋白原作為支架，結(jié)合ADSCs用于大鼠全層真皮缺損創(chuàng)面的研究，發(fā)現(xiàn)電紡絲彈性蛋白原與ADSCs有著良好的生物相容性，通過與對照組的比較發(fā)現(xiàn)，明顯加快了創(chuàng)面愈合。Gu等[24]使用電紡絲聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物作為支架，結(jié)合ADSCs修復(fù)大鼠創(chuàng)面，加速了創(chuàng)面愈合速度。

3 ADSCs修復(fù)難愈性創(chuàng)面

慢性難愈性創(chuàng)面一直是困擾臨床醫(yī)師的難題。難愈性創(chuàng)面可見于創(chuàng)面的慢性感染、糖尿病所致的微循環(huán)障礙、放療等。ADSCs在慢性創(chuàng)面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)傷口的愈合。

3.1 糖尿病慢性潰瘍 糖尿病患者皮膚易損傷，損傷后往往反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，形成難愈性創(chuàng)面。ADSCs用于糖尿病創(chuàng)面的治療，為改善創(chuàng)面預(yù)后提供了新的思路。Zografou、Kim、Maharlooei等[10,25-26]將ADSCs注射于糖尿病老鼠創(chuàng)面邊緣，均發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面的愈合速度較對照組高，實(shí)驗(yàn)組在上皮化、膠原沉積、血管生成等方面有較明顯改變。Nambu等[27]將分離出的初代ADSCs結(jié)合帶硅膠膜片的膠原蛋白支架，移植在糖尿病模型老鼠的全層缺損創(chuàng)面，創(chuàng)面愈合時(shí)間較對照組縮短，上皮化水平、毛細(xì)血管密度都有明顯提高。Nie等[28]將ADSCs結(jié)合脫細(xì)胞真皮支架用于糖尿病老鼠的創(chuàng)面，蛋白定量分析顯示，VEGF、HGF等血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)大幅上調(diào)，這使得創(chuàng)面血管密度、上皮化水平、組織增生有明顯提高，這些促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合。

3.2 放射創(chuàng)面 放射損傷能造成細(xì)胞損壞并伴隨諸多的調(diào)控失調(diào)，從而延緩創(chuàng)面愈合。Haubner等[29]用2-12Gy輻射照射真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞與ADSCs共培養(yǎng)的模型發(fā)現(xiàn)，ADSCs能降低內(nèi)皮細(xì)胞接受輻射后引起的多種細(xì)胞因子和黏附因子的表達(dá)水平，從而穩(wěn)定創(chuàng)面，加快愈合。Forcheron等[30]將ADSCs皮內(nèi)注射于受輻射的小型豬，80%的豬創(chuàng)面得以愈合，而對照組則全部發(fā)生壞死。免疫組化分析角蛋白表達(dá)顯示，創(chuàng)面完全上皮化。Huang等[31]用ADSCs治療接受輻射的老鼠，3周后創(chuàng)面較對照組有明顯縮小，組織檢查和免疫印跡顯示，創(chuàng)面邊緣再上皮化區(qū)域有血管長入；細(xì)胞追蹤實(shí)驗(yàn)顯示，創(chuàng)面中的ADSCs表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)志物。

綜上所述，ADSCs對于創(chuàng)面的愈合改善有一定的作用，其機(jī)制和效率仍有待進(jìn)一步研究。如何提高ADSCs修復(fù)創(chuàng)面的效率也是最近研究的熱點(diǎn)，對干細(xì)胞的基因改造、細(xì)胞微環(huán)境改善、細(xì)胞膜片技術(shù)，都在實(shí)驗(yàn)室得到了一定肯定，但是在臨床應(yīng)用中，其安全性仍有待考證。相信隨著今后對ADSCs更深入地研究，其在臨床中用于修復(fù)復(fù)雜性難愈性創(chuàng)面將可能實(shí)現(xiàn)。

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200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院 整形外科

張?jiān)?1989-)，男，浙江人，住院醫(yī)師，碩士研究生.

楊 超，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院 整形外科，電子信箱：13916086222@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.12.015

2014-10-12)