胡政香，孟慶玲＊，喬 軍，趙海龍，馬 玉，劉田莉，贊哈爾·波拉提，才學(xué)鵬，陳創(chuàng)夫

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州730046）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasmaovipneumoniae，MO）是引起綿羊傳染性胸膜肺炎（Contagious ovinepleuropneumonia）的一種慢性呼吸道疫病的病原，它不僅能感染綿羊，同時(shí)也可感染山羊，主要危害1月齡到3月齡的羔羊，在臨床上以高熱流鼻涕、咳嗽、漸進(jìn)性消瘦和增生性間質(zhì)性肺炎為主要特征［1－3］。此外，羊感染MO 后，會(huì)出現(xiàn)免疫抑制，引起其他病原繼發(fā)感染，導(dǎo)致感染動(dòng)物死亡［4－5］。

新疆是我國五大牧區(qū)之一，綿羊養(yǎng)殖業(yè)在畜牧業(yè)中占有重要的地位。近幾年，在新疆多個(gè)地區(qū)種羊場先后疑似綿羊傳染性胸膜肺炎的疾病，發(fā)病率可達(dá)40～60%，給新疆養(yǎng)羊業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，開展MO 病原學(xué)及致病機(jī)制研究對于該病的科學(xué)防控具有重要的意義。然而，目前有關(guān)MO 研究較少，尤其是對于重要毒力因子缺乏了解，因此對其致病分子機(jī)制知之甚少［6］。2013年，有人首次對MO SC01株進(jìn)行全基因組的測序研究，預(yù)測和發(fā)現(xiàn)了MO 的一些重要毒力基因［7］。為了研究MO 毒力因子，本試驗(yàn)對MO 新疆分離株溶血素（hemolysin，TlyC）進(jìn)行克隆和測序，并對TlyC基因及其編碼氨基酸序列進(jìn)行分子特征分析，旨在了解MOTlyC生物學(xué)功能及其在致病中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

綿羊肺炎支原體新疆分離株（MO XJ分離株）分離自新疆某羊場送檢的疑似MO 感染羊的病料。LB培養(yǎng)基由本研究室自配（10g胰蛋白胨，10g氯化鈉，5g酵母提取物，加蒸餾水定容至1L）。Taq plus DNA 聚合酶、dNTPs、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自上海生物工程公司，pMD18－T 載體和2000bp DNA Ladder Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的TlyC基因序列（WP＿010320917），采用Premier 5.0引物軟件設(shè)計(jì)綿羊肺炎支原體TlyC 編碼序列的特異性引物：上游引物TlyC－f：5＇－ATGCCGGGTTATTTTATTG－3＇；下游引物TlyC－r：5＇－TTAGCTTTTTTGTTGGAATTC－3＇。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 MO 基因組的提取

將病料置于研磨器中加適量的蒸餾水，進(jìn)行研磨，然后按照DNA 提取試劑盒說明書操作進(jìn)行提取支原體DNA。

1.4 PCR 擴(kuò)增及序列克隆

設(shè)計(jì)總反應(yīng)體系為50μL，體系成分：取提取的DNA 模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol／L dNTPs 4μL，TlyC－f（25μm／L）、TlyC－r（25μm／L）各1μL，d3H2O 36.8μL，Taq DNA 聚合酶（5 U／μL）0.2μL 混勻。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃3min 20s，變性94 ℃40s，退火50 ℃40s，延伸72 ℃1min 30s。最后降溫至4 ℃保存。

將PCR 產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠，以0.5×TAE緩沖液，130V 電壓電泳12min。電泳完成后，置于電泳凝膠紫外成像儀中觀察。對擴(kuò)增得到的PCR粗產(chǎn)物再用回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將純化回收產(chǎn)物片段和載體pMD18－T 連接過夜，次日轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，在氨芐青霉素平板上進(jìn)行篩選，然后做菌落PCR反應(yīng)進(jìn)一步篩選驗(yàn)證。

1.5 序列測定與分子特征分析

圖1 TlyC 序列PCR 擴(kuò)增結(jié)果1－4.基因擴(kuò)增產(chǎn)物；5.陰性對照；M.2000bp DNA Ladder MarkerFig.1 Amplification product test results of hemolysin TlyCgene by PCR1－4.gene amplitication product；5.negative control；M.2000bp DNA Ladder Marker

圖2 TlyC 序列陽性克隆菌落PCR 擴(kuò)增結(jié)果1－4.菌液PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；5.陰性對照；M.2000bp DNA Ladder MarkerFig.2 Amplification product test results of TlyCgene of MO1－4.bacteriun solution PCR amplificantion product；5.neg－ative control；M.2000bp DNA Ladder Marker

將驗(yàn)證正確的重組載體產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司直接測定核苷酸序列。利用生物在線分析軟件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／，http：／／www.expasy.org／tools／）對TlyC基因編碼氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)、信號肽、跨膜區(qū)、結(jié)構(gòu)域、二級及三級結(jié)構(gòu)等分析，采用NJ法（Neighbor－Joining Method），應(yīng)用MEGA5.0等軟件對MO 新疆分離株和GenBank中發(fā)表的MO 及相關(guān)支原體菌株的溶血素基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增與克隆結(jié)果

經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，成功擴(kuò)增得到大小約為1 239bp的核酸片段（圖1）。與預(yù)期大小相符；陽性克隆菌菌液也能擴(kuò)增出相同大小生物核酸片段，表明成功克隆出TlyC基因（圖2）。

2.2 TlyC 基因測序結(jié)果及其序列分析

經(jīng)測序，TlyC基因全長1 239bp，含起始密碼子ATG，終止密碼子TAA，編碼412個(gè)氨基酸，分子量約為42.5kDa。Signal IP 3.0Server在線軟件分析TlyC基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)第1～23個(gè)氨基酸為信號肽序列。分析發(fā)現(xiàn)，疏水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中，且多于親水性氨基酸。TMHMM 軟件分析發(fā)現(xiàn)，TlyC存在四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（4－26、62－84、94－116、123－145）。Prosite scan軟件分析發(fā)現(xiàn)，TlyC存在兩個(gè)CBS（胱硫醚β合成酶）（204－251和260－310）。CBS 結(jié)構(gòu)域常出現(xiàn)在各種具有相互作用的蛋白上，CBS可能在蛋白與蛋白的相互作用中起著重要的調(diào)控作用（圖3）。

2.3 TlyC 蛋白二級及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析

MOTlyC蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TlyC二級結(jié)構(gòu)包括248個(gè)氨基酸（占55.83%）可能形成α－螺旋（h）、76個(gè)氨基酸（占18.45%）可形成延伸鏈（e）、78個(gè)氨基酸（占18.93%）可形成無規(guī)卷曲（c）、28個(gè)氨基酸（占6.80%）可形成β－轉(zhuǎn)角（t），但沒有β－折疊。由此可知該蛋白質(zhì)主要以α－螺旋為主（圖4）。三級結(jié)構(gòu)呈一個(gè)L型球蛋白的結(jié)構(gòu)（圖5）。

2.4 TlyC 基因相似性比較及遺傳進(jìn)化分析

用DNAMAN 軟件氨基酸預(yù)測同源性得出；MO 新疆分離株與豬肺炎支原體232 株相似性為81.95%，與絮狀支原體相似性為80.49%，除此之外與結(jié)膜支原體、毛氏霉形體、豬鼻支原體HUB－1株也具有較高相似性，三者間氨基酸序列相似性分別60.68%、59.71%和48.53%。用MEGA5.0軟件分析GenBank中發(fā)表的豬鼻支原體、豬肺炎支原體、絮狀支原體、滑液囊支原體、結(jié)膜支原體等株TlyC基因繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖6。由圖6 知，MO 新疆分離株與豬肺炎支原體232株，絮狀支原體聚為一支，親緣關(guān)系較近，而與其他株的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，表明MO 新疆分離株與豬肺炎支原體232株和絮狀支原體可能來自同一祖先。

圖3 TlyC 基因核苷酸及其編碼氨基酸序列TlyC 基因含有的信號肽位于序列的第1～23位（紅色波浪線標(biāo)定字體）；4個(gè)跨膜區(qū)（方框）；4個(gè)N 末端糖基化位點(diǎn)（加粗斜體）；2個(gè)CBS（灰色區(qū)）Fig.3 Nucleotide sequence and amino acids sequence of serine protease of TlyCThe signal peptide of the TlyCgene located in the sequence of 1～23is underlined with a red wavy line calibration font；the 4transmembrane regions are underlined with box respectively；the 4N－terminal glycosylation sites are underlined in bold and italic；2CBS（gray area）

圖4 TlyC 二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.4 Prediction of secondary structure of TlyC

3 討論

自從1963年首次分離到MO 后，世界各國和地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)此病，目前其在全球范圍內(nèi)分布，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［8－13］。在國內(nèi)，胡景韶等［1］首次從發(fā)病綿羊上分離得到，并隨后在遼寧、云南、甘肅、四川、江蘇、新疆等地都有從患肺炎綿羊中分離到的報(bào)道，證實(shí)我國廣泛存在綿羊支原體肺炎病［14－16］。新疆是我國五大牧區(qū)之一，也是我國重要的養(yǎng)羊基地，近幾年從內(nèi)地引進(jìn)了大批湖羊，實(shí)行集約化飼養(yǎng)，在引進(jìn)后先后在數(shù)個(gè)湖羊種羊場爆發(fā)該病，常規(guī)治療無效，發(fā)病率和病亡率很高，給新疆養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2012年，通過對12個(gè)新疆養(yǎng)羊場抽樣調(diào)查表明，新疆綿羊MO 的感染率為在32.6%～64.6%，病死率在8%～10%之間。

圖5 TlyC 三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.5 Prediction of tertiary structure of TlyC

圖6 采用NJ法基于TlyC 基因的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.6 Phylogenetic analysis of Mycoplasmao vipneumoniae based on TlyCgene with Neighbor－Joining（NJ）MethodHemolysin C Mycoplasma alkalescens，WP＿002882049；Hemolysin C Mycoplasma auris，WP＿004424724；Hemolysin C Mycoplasma arginini（WP＿004415532）；Hemolysin C Mycoplasma hominis ATCC 23114（YP＿003302648）；Hemolysin C Mycoplasma fermentans JER（YP＿003923114）；Hemolysin related protein Mycoplasma agalactiae（YP＿003515428）；Hemolysin－like protein Mycoplasma agalactiae PG2（YP＿001256381）；Hemolysin C Mycoplasma crocodyli MP145（YP＿003560070）；Hemolysin C Mycoplasma synoviae 53（YP＿278547）；Hemolysin C Mycoplasma hyorhinis HUB－1（YP＿003856243）；Hemolysin Mycoplasma moatsii（WP＿022934672）Hemolysin C Mycoplasma conjunctivae HRC581（YP＿002960689）；Hemolysin Mycoplasma hyopneumoniae 232（YP＿116171）；Hemolysin C Mycoplasma flocculare（WP＿002557956）；Hemolysin C Mycoplasma pulmonis UAB CTIP（NP＿326345）；Hemolysin activation protein Ruminococcus albus（WP＿002853574）

MO 不但引起綿羊支原體肺炎，而且還能引起機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制，易繼發(fā)其他病原感染，導(dǎo)致較高的死亡率。然而，目前有關(guān)MO 毒力基因及其致病分子機(jī)制研究較少［2］。溶血素（TlyC）被認(rèn)為是許多病原菌的主要致病因子，能導(dǎo)致紅細(xì)胞膜破裂發(fā)生溶血，在支原體致病過程中發(fā)揮重要作用。本研究以MO 溶血素TlyC為研究對象，對TlyC基因的氨基酸序列組成、結(jié)構(gòu)域、二級和三級結(jié)構(gòu)、同源性及遺傳進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測和分析。預(yù)測結(jié)果顯示：擴(kuò)增所得的TlyC 序列為1239bp；多肽鏈表現(xiàn)為疏水性；在第1～23位有信號肽、3個(gè)N 末端糖基化位點(diǎn)、4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)；以α－螺旋為主要二級結(jié)構(gòu)元件，具CBS結(jié)構(gòu)域的功能位點(diǎn)。同源性分析得知，MO 新疆分離株TlyC與豬肺炎支原體232株和絮狀支原體相應(yīng)的TlyC基因相似性分別為81.95%和80.49%；同時(shí)，MO與結(jié)膜支原體、毛氏霉形體、豬鼻支原體HUB－1株也具有一定的同源性，三者TlyC基因核苷酸同源性性分別60.68%、59.71%和48.53%。遺傳進(jìn)化樹顯示，MO 新疆分離株與豬肺炎支原體232株和絮狀支原體相處于同一枝，表明三者的親緣關(guān)系較近，與其他的株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究首次克隆了MOTlyC基因，為了解MO TlyC生物學(xué)功能及其致病中的作用奠定了前期基礎(chǔ)。

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