張 靜，李倜宇，史彬林，閆素梅，娜仁花，紅 雷，郭曉宇

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

全球氣候變暖受到了國際社會的普遍關(guān)注，其主要原因是人類活動排放了大量的二氧化碳（CO2）、甲烷（CH4）和氧化亞氮（N2O）等溫室氣體，而畜牧業(yè)是溫室氣體排放的一個重要來源。在畜牧業(yè)中，隨著我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，奶牛排放的溫室氣體增長最快，1980～2009年間增加了21.78倍［1］，奶牛甲烷排放量達到了動物排放總量的19.38%。據(jù)估測，奶牛約94% 的甲烷是由瘤胃產(chǎn)生的［2］，這不僅導(dǎo)致了氣候變暖，而且造成飼料能量的損失［3］。雖然甲烷在大氣中的含量比二氧化碳的含量少，但其溫室效應(yīng)是二氧化碳的23倍，而且甲烷在大氣中的壽命也比二氧化碳短，可見對甲烷減排要比控制二氧化碳在緩解溫室效應(yīng)方面更快更容易。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計估算，到2030年甲烷對全球氣候變暖的貢獻率可能達到50%，將成為頭號溫室氣體［4］。因此，減少奶牛瘤胃內(nèi)甲烷的生成對提高飼料能量利用率和改善環(huán)境具有雙重意義。所以，研究和開發(fā)具有降低奶牛溫室氣體排放的綠色飼料添加劑是非常必要的。目前，殼聚糖作為自然界中唯一的堿性多糖，具有多種生物活性，可增強動物免疫力，提高生產(chǎn)性能，抑制細(xì)菌、霉菌的生長活性，同時在醫(yī)藥、化工、食品等方面也有廣泛的用途［5］。有研究結(jié)果顯示，殼聚糖在一定程度上可改善瘤胃能量發(fā)酵，從而減少甲烷的排放量［6］。但相關(guān)研究報道甚少，本試驗利用體外培養(yǎng)技術(shù)，研究添加不同水平的殼聚糖對奶牛人工瘤胃溫室氣體排放的影響，為殼聚糖在奶牛生產(chǎn)中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及人工唾液的制備

本試驗所用殼聚糖購于山東濟南海德貝海洋生物工程有限公司，黏度為45cps，脫乙酰度為85.09%。瘤胃液是在健康的荷斯坦奶牛經(jīng)屠宰后，立即采集不同位點瘤胃內(nèi)容物約600mL，經(jīng)4層紗布過濾后，將濾液放入通有CO2并預(yù)熱達39 ℃的保溫瓶中，備用。

人工唾液由常量元素溶液、微量元素溶液、緩沖溶液、指示劑溶液和還原性溶液配制而成。各種溶液的配制方法見表1［7］。人工唾液的配制方法為：按順序?qū)?00mL 蒸餾水，200mL A 液，0.1mL B液，200mL C 液和1.0mL D 液加入廣口瓶中，并將廣口瓶放入39℃恒溫振蕩水浴鍋中，最后加入40 mL還原性溶液，整個過程持續(xù)通入CO2，培養(yǎng)液顏色由藍色逐漸變?yōu)榧t色再到無色，此時表示已達到厭氧條件即可使用。

表1 人工唾液中各單一溶液配方Table 1 Formula of each single solution in artificial saliva

1.2 試驗設(shè)計

采用注射器式培養(yǎng)系統(tǒng)體外模擬瘤胃發(fā)酵（Menke，1979）［8］。試驗分為1 ～12h和13～24h兩個時期，設(shè)置5個處理，每個處理6個重復(fù)，分別添加0%、0.3%、0.6%、1.2% 和2.4% 的殼聚糖。各處理組的培養(yǎng)底物均為0.5g，基礎(chǔ)底物組成相同，其中精料占40%，苜蓿占44%，羊草占16%。

表2 發(fā)酵底物組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 2 Composition and nutrient levels of fermentation substrate（air－dry basis）

1.3 試驗方法

將人工唾液與瘤胃液（人工唾液∶瘤胃液＝2∶1）混合配成人工瘤胃培養(yǎng)液，抽取60mL 人工瘤胃培養(yǎng)液加入每個裝有底物樣品并在39 ℃下預(yù)熱后的培養(yǎng)瓶中，然后持續(xù)向培養(yǎng)瓶內(nèi)充CO2氣體4～5 min后，蓋緊橡膠瓶塞，放入39 ℃恒溫振動速度為40r／min水浴搖床中厭氧培養(yǎng)24h。

1.4 測定指標(biāo)

試驗開始后，每隔2h用20mL 密封且潤滑性良好的注射器將培養(yǎng)體系產(chǎn)生的氣體測定一次，每次記錄完后放氣，使注射器的刻度歸零，將測定結(jié)果進行累計得到12和24h 反應(yīng)體系中的總產(chǎn)氣量。用膠帶固定10mL注射器針筒與活塞芯桿的位置，每隔2h抽取1.5mL氣體，12h換一只注射器，分別在培養(yǎng)時間12和24h累計采集9mL氣體，用Agilent 6890A 氣相色譜儀（美國）測定氣樣中CH4、CO2及N2O的質(zhì)量濃度，然后分別乘以相應(yīng)培養(yǎng)時間的總產(chǎn)氣量計算得出CH4、CO2及N2O產(chǎn)生量。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同水平殼聚糖對1～12h人工瘤胃溫室氣體排放的影響

由表3可見，1～12h，各殼聚糖處理組CH4的產(chǎn)量均低于對照組。從回歸統(tǒng)計結(jié)果得出，人工瘤胃中CH4的產(chǎn)氣量隨殼聚糖添加劑量的升高呈現(xiàn)一次線性降低趨勢（P＝0.074），以添加1.2% 殼聚糖組的CH4產(chǎn)量最低。人工瘤胃中CO2，N2O 的產(chǎn)量與殼聚糖的添加量沒有顯著的劑量依賴關(guān)系（P＞0.05）。

表3 添加不同水平殼聚糖對1～12h人工瘤胃溫室氣體排放的影響Table 3 Effect of different dietary chitosan on the greenhouse gas emission during 1～12h

2.2 添加不同水平殼聚糖對13～24h人工瘤胃溫

室氣體排放的影響

不同水平殼聚糖對13～24h人工瘤胃溫室氣體排放的影響見表4。從表4可見，13～24h，各殼聚糖處理組CH4的產(chǎn)量均低于對照組，從回歸統(tǒng)計結(jié)果得出，隨殼聚糖添加劑量的升高，各培養(yǎng)瓶中CH4的產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著的一次線性（P＝0.05）降低，而培養(yǎng)體系中CO2和N2O 的產(chǎn)量變化不顯著（P＞0.05）。從方差統(tǒng)計結(jié)果得出，添加0.6%、1.2%、2.4%的殼聚糖處理組CH4產(chǎn)量顯著低于對照組，并且添加1.2%的殼聚糖處理組效果最好。

表4 添加不同水平殼聚糖對13～24h人工瘤胃溫室氣體排放的影響Table 4 Effect of different dietary chitosan on the greenhouse gas emission during 13～24h

3 討論

反芻動物瘤胃主要靠寄居其內(nèi)部大量的細(xì)菌、原蟲和厭氧真菌等微生物來消化各種飼料。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，反芻動物瘤胃中82%的甲烷是通過數(shù)種甲烷菌以H2和CO2為底物進行還原反應(yīng)生成的［9］，可見瘤胃內(nèi)CH4的生成與產(chǎn)甲烷菌的活性有關(guān)［10］。本試驗采用人工瘤胃法體外模擬反芻動物的瘤胃來探究殼聚糖對奶牛瘤胃溫室氣體排放的影響，此方法不僅可以比較準(zhǔn)確地探究飼料添加劑的作用效果，而且此方法具有低成本，易控制等優(yōu)點［11］。本試驗結(jié)果表明，添加適宜劑量的殼聚糖可以降低人工瘤胃中CH4的產(chǎn)量，其原因可能是由于殼聚糖分子中的－NH3＋帶正電性，可吸附在產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞的表面或通過滲透進入細(xì)胞內(nèi)，擾亂細(xì)胞正常的生理活動［12］，從而降低了產(chǎn)甲烷菌的活性。

有學(xué)者研究了殼聚糖對瘤胃甲烷產(chǎn)生及發(fā)酵特性的影響，結(jié)果表明，人工瘤胃中添加1500 mg的殼聚糖，厭氧培養(yǎng)9d（7d適應(yīng)期和2d采樣期）可以顯著降低羯羊人工瘤胃中甲烷的產(chǎn)量［13］。另有學(xué)者利用人工瘤胃長期系統(tǒng)（Rusitec系統(tǒng)）體外培養(yǎng)96h研究發(fā)現(xiàn)，添加1380mg的殼聚糖可以降低人工瘤胃長期系統(tǒng)中甲烷的產(chǎn)量［14］。以上研究結(jié)果都與本試驗的結(jié)果一致，說明添加適宜劑量的殼聚糖可在一定程度上降低瘤胃CH4的產(chǎn)量，從而影響瘤胃溫室氣體的排放，緩減對環(huán)境的溫室效應(yīng)，但其確切的作用機制尚不清楚，還需進一步探究確定。

4 結(jié)論

通過本試驗初步得出：人工瘤胃中添加殼聚糖可以降低CH4的產(chǎn)量，且以添加1.2%殼聚糖的效果較好。該結(jié)果提示，在奶牛日糧中添加適宜劑量的殼聚糖可在一定程度上緩解大氣的溫室效應(yīng)。

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