海 汀，柴志欣，張成福，信金偉，姬秋梅，曾賢彬，鐘金城＊

（1.西南民族大學(xué)動(dòng)物遺傳育種學(xué)國(guó)家民委／教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩850000）

牦牛（Bos grunniens）享有“高原之舟”和“全能家畜”的美譽(yù)，是西藏高山草原的主體畜種，主要分布于喜馬拉雅山脈和青藏高原。牦牛是經(jīng)長(zhǎng)期自然選擇和人工選擇形成的特有牛種，在遺傳上是一個(gè)寶貴的基因庫(kù)［1－2］。西藏自治區(qū)是牦牛的主產(chǎn)地之一，現(xiàn)有牦牛500余萬(wàn)頭，占全國(guó)牦?？倲?shù)的29%以上。生態(tài)環(huán)境和地理?xiàng)l件的差異使西藏牦牛形成了多個(gè)特有的地方品種或類群，遺傳資源極其豐富［3］。我國(guó)針對(duì)牦牛的科學(xué)研究始于20世紀(jì)60年代，學(xué)者們利用形態(tài)遺傳標(biāo)記、細(xì)胞遺傳標(biāo)記、生化遺傳標(biāo)記和分子遺傳標(biāo)記等技術(shù)對(duì)牦牛品種的遺傳多樣性及分類進(jìn)行了廣泛深入的研究，取得了階段性的成果［4］。

動(dòng)物線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是核外遺傳物質(zhì)，沒有經(jīng)過基因重組，分子各部分共享同一祖先相同歷史模式［5－6］，在研究物種起源、演化和分類中是理想的分子遺傳標(biāo)記［7］。近年來，對(duì)西藏牦牛線粒體DNA 的研究多集中于Dloop區(qū)、細(xì)胞色素c氧化酶基因（cox）、細(xì)胞色素b基因（cytb）等，利用NADH 脫氫酶基因研究西藏牦牛相對(duì)較少。在NADH 脫氫酶中，mtDNA ND6基因片段短、進(jìn)化速度適中、序列變異豐富，適合研究物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系［8］。目前，利用ND6基因?qū)ξ鞑仃笈５倪z傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化的研究尚未見報(bào)道。本研究通過對(duì)西藏15 個(gè)牦牛類群mtDNA ND6基因序列多態(tài)性研究，分析西藏牦牛遺傳多樣性及其類群間的親緣關(guān)系，以期為西藏牦牛類群的界定提供一定的分子遺傳標(biāo)記依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

從15個(gè)西藏牦牛類群中，各選取成年健康牦牛10頭，共150頭（表1），采集耳組織，75%乙醇保存帶回實(shí)驗(yàn)室，于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA 的提取及檢測(cè)

用動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒（TianGen生物技術(shù)公司）提取基因組DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)雙重檢測(cè)DNA 的純度和濃度，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR 擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中公布的牦牛線粒體全基因組序列（NC＿006380.3）中的mtDNA ND6基因核苷酸序列，用Primer Premier5.0 設(shè)計(jì)引物：F：5′－CCCCTCAAACGCCTTCAAA－3′，R：5′－GCGACCGAAGTTTCACCA－3′（引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成）。PCR 總反應(yīng)體系為25μL，其中，上、下游引物各1μL（10pmol·μL－1），DNA 模板1μL（200～600ng·μL－1），Ex Taq DNA 預(yù)混酶12.50 μL（0.625U），滅菌ddH2O 9.50μL。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性45s、56.3℃退火30s、72℃延伸1min 30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4 ℃保存。

1.4 目的基因測(cè)序

PCR 擴(kuò)增后，其產(chǎn)物在1.3%的瓊脂糖凝膠（含GlodView 核酸染料）電泳分離，PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒（OMEGA）回收、純化后，進(jìn)行正反雙向測(cè)序。

1.5 分析方法和軟件

用DNAMAN 軟件對(duì)150頭西藏牦牛的mtDNA ND6基因全序列進(jìn)行校對(duì)，用ClustalX1.83軟件進(jìn)行比對(duì)，用MEGA5.0軟件統(tǒng)計(jì)mtDNA ND6基因全序列的堿基組成，計(jì)算類群間遺傳距離并以非加權(quán)平均值法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means，UPGMA）構(gòu)建品種間聚類關(guān)系；用DnaSP5.0軟件分析多態(tài)位點(diǎn)、核苷酸多樣性以及單倍型多樣性。

表1 供試牦牛類群、數(shù)量及采樣地點(diǎn)Table 1 Tibetan yak sampling details

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏牦牛mtDNA ND6基因的序列多態(tài)性

本研究中，西藏牦牛15個(gè)類群的150個(gè)個(gè)體的mtDNA ND6 基因全序列經(jīng)對(duì)位排列，長(zhǎng)度均為528bp，起始密碼子為AUG（ATG），終止密碼子為UAA（TAA），基因間沒有內(nèi)含子，編碼175個(gè)氨基酸。T、C、A 和G 4 種堿基的平均比例分別為42.2%（40.9%～42.4%）、7.6%（7.4%～8.7%）、20.9% （20.6% ～22.2%）、29.3% （28.2% ～29.5%），A＋T 含量（63.1%）顯著高于G＋C 含量（36.1%），表明西藏牦牛富含堿基A 和T。

西藏15個(gè)牦牛類群的序列多態(tài)性見表2，從西藏15個(gè)牦牛類群內(nèi)分析，類烏齊牦牛的多態(tài)位點(diǎn)最多為38個(gè)，其中單態(tài)突變位點(diǎn)36個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)2個(gè)，類烏齊牦牛的多態(tài)性較其他牦牛類群豐富。從西藏15個(gè)牦牛類群間分析，在全序列中共發(fā)現(xiàn)41 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率（percentage of polymorphic sites）為7.76%，其中單態(tài)突變位點(diǎn)37個(gè)（位于25、30、36、39、45、54、93、120、132、135、147、150、154、159、162、168、186、198、228、237、243、249、280、303、312、321、333、336、339、343、378、390、405、414、432、453、486位堿基處），約占多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)的90.24%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4個(gè)（位于51、69、297、327位堿基處），約占多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)的9.76%，群體間多態(tài)性較為貧乏。序列變異中存在轉(zhuǎn)換、顛換2種核苷酸變異類型，其中轉(zhuǎn)換37 次，顛換2 次，轉(zhuǎn)換／顛換（Ts／Tv）比為18.5：1，表明西藏牦牛核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的變異主要是以轉(zhuǎn)換為主。在轉(zhuǎn)換變異類型中，A→G 轉(zhuǎn)換次數(shù)最多為23次，約占轉(zhuǎn)換總次數(shù)的58.97%，C→T 轉(zhuǎn)換次數(shù)最少為6次，約占轉(zhuǎn)換總次數(shù)的16.22%。

表2 西藏15個(gè)牦牛類群mtDNA ND6的序列多態(tài)性位點(diǎn)Table 2 MtDNA ND6gene sequence polymorphisms sites of 15breeds of Tibetan yaks

本研究中根據(jù)西藏15個(gè)牦牛類群的150個(gè)個(gè)體的序列，共定義出7種單倍型（表3），其中Hap＿1為共享單倍型，在西藏15個(gè)牦牛類群中均有發(fā)現(xiàn)，Hap＿1 為西藏牦牛類群的主流單倍型。其余6 種單倍型為部分類群所特有，其中Hap＿2 共出現(xiàn)19次，分布于丁青牦牛、工布江達(dá)牦牛、江達(dá)牦牛、類烏齊牦牛、隆子牦牛、聶榮牦牛、帕里牦牛、桑日牦牛，Hap＿4共出現(xiàn)5次，分布于聶榮牦牛、帕里牦牛、康布牦牛、錯(cuò)那牦牛，Hap＿3、Hap＿5、Hap＿6、Hap＿7均只出現(xiàn)1次，分布于康布牦牛、丁青牦牛、工布江達(dá)牦牛、類烏齊牦牛，各類群間單倍型的類型和數(shù)目存在一定差異。

表3 西藏15個(gè)牦牛類群mtDNA ND6的單倍型Table 3 MtDNA ND6gene haplotypes of 15breeds of Tibetan yaks

2.2 西藏牦牛mtDNA ND6基因的遺傳多態(tài)性

對(duì)西藏15個(gè)牦牛類群的150個(gè)個(gè)體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性進(jìn)行分析（表4），結(jié)果表明，平均單倍型數(shù)（H）、平均單倍型多樣性（Hd）和平均核苷酸多樣性（Pi）分別為2.0667、0.2978、0.00191。西藏15個(gè)牦牛類群的單倍型多樣性的變化范圍在0～0.644之間，核苷酸多樣性的變化范圍在0～0.01566之間，單倍型多樣性和核苷酸多樣性的結(jié)果變化有較強(qiáng)相關(guān)性。類烏齊牦牛的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最高，分別為0.644、0.01566，嘉里牦牛、斯布牦牛、桑桑牦牛、仲巴牦牛、日多牦牛的單倍型多樣性和核苷酸多樣性最低，均為0，結(jié)果表明，除類烏齊牦牛外，西藏其他牦牛類群的單倍型多樣性和核苷酸多樣性較貧乏。

表4 西藏牦牛mtDNA ND6的單倍型多樣性、核苷酸多樣性和個(gè)體間的遺傳距離Table 4 Haplotype diversity，nucleotide diversity and genetic distance of Tibet yaks

2.3 西藏牦牛類群間的遺傳距離和聚類分析

用Mega5.0軟件對(duì)西藏15個(gè)牦牛類群的分子遺傳距離進(jìn)行計(jì)算（表5），結(jié)果表明，西藏15個(gè)牦牛類群間的遺傳距離的變化范圍在0～0.009247之間，其中仲巴（ZB）牦牛、桑桑（SS）牦牛、斯布（SB）牦牛、日多（RD）牦牛、嘉里（JL）牦牛之間任意兩個(gè)的遺傳距離均為0，類烏齊（LWQ）牦牛與帕里（PL）牦牛的遺傳距離最大為0.009247，類烏齊牦牛與其他牦牛類群的遺傳距離的差異顯著高于其他牦牛類群間的差異。

表5 基于mtDNA ND6基因的西藏牦牛類群間的Kimura 2－parameterTable 5 Kimura－caculated genetic distance between Tibetan yaks based on mtDNA ND6gene （10－3）

根據(jù)mtDNAND6基因的遺傳距離，用非加權(quán)平均值法（UPGMA）對(duì)西藏牦牛15個(gè)牦牛類群進(jìn)行聚類分析（圖1），結(jié)果表明日多牦牛、嘉里牦牛、斯布牦牛、桑桑牦牛、仲巴牦牛、錯(cuò)那牦牛先聚為一類，然后再依次與江達(dá)牦牛、桑日牦牛、康布牦牛、工布江達(dá)牦牛、聶榮牦牛、丁青牦牛、帕里牦牛、隆子牦牛相聚，最后才與類烏齊牦牛相聚。

2.4 西藏牦牛類群的單倍型系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)西藏15個(gè)牦牛類群的7種單倍型序列，用非加權(quán)平均值法（UPGMA）構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果表明，系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩支，其中Hap＿7單獨(dú)聚為一類，僅包括類烏齊牦牛；其余單倍型序列聚為一類，包括西藏15個(gè)牦牛類群，可以看出西藏牦牛有兩個(gè)母系起源。

圖1 西藏15個(gè)牦牛類群間的UPGMA 分子聚類關(guān)系圖Fig.1 UPGMA dendrogram of 15Tibetan yak populations

圖2 西藏牦牛類群的單倍型系統(tǒng)發(fā)育UPGMA 樹Fig.2 UPGMA tree of haplotypes phylogenetic of Tibetan yaks

3 討論

3.1 西藏牦牛類群的序列多態(tài)性

本試驗(yàn)對(duì)西藏牦牛mtDNAND6 基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)基因全序列長(zhǎng)度均為528bp，個(gè)體間無序列長(zhǎng)度差別，這與童曉梅［10］、陳曉芳［11］對(duì)藏雞和鳥類的mtDNAND6基因研究結(jié)果有一定差異，可能是不同物種間線粒體基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)并不完全相同［6］。通過對(duì)西藏15個(gè)牦牛類群的150個(gè)個(gè)體的mtDNAND6基因序列進(jìn)行分析比較，共發(fā)現(xiàn)了7種單倍型，41 個(gè)變異位點(diǎn)，其中單態(tài)突變位點(diǎn)37個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4個(gè)，群體間多態(tài)性較貧乏。這與張成福等［12］對(duì)西藏11 個(gè)牦牛類群114 個(gè)個(gè)體的mtDNAD－loop區(qū)的研究結(jié)果差異較大，而與趙上娟［13］等對(duì)西藏11 個(gè)牦牛類群的mtDNACOⅢ基因的測(cè)序分析結(jié)果相近，這可能是因?yàn)閙tDNADLoop區(qū)是mtDNA 基因組中進(jìn)化速率最高、最具多態(tài)的區(qū)域［14］，而mtDNAND6基因與mtDNACOⅢ基因的進(jìn)化速率相當(dāng)。本試驗(yàn)中，存在轉(zhuǎn)換、顛換2種核苷酸變異類型，其中轉(zhuǎn)換37次，顛換2次，轉(zhuǎn)換（Ts）和顛換（Tv）的比值R 為18.5，表明西藏牦牛具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)換偏倚性。黃原［15］認(rèn)為如果R 大于2，說明序列替換遠(yuǎn)未達(dá)到飽和。因此推測(cè)，隨著分歧時(shí)間的增加，西藏牦牛mtDNAND6基因序列中顛換數(shù)會(huì)增加，轉(zhuǎn)換偏倚會(huì)下降。

3.2 西藏牦牛類群的遺傳多態(tài)性

生物多樣性是人類社會(huì)賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)，遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，因此對(duì)動(dòng)物遺傳多樣性的合理開發(fā)和可持續(xù)利用顯得尤為重要［16］。西藏牦牛養(yǎng)殖數(shù)量占全國(guó)牦?？倲?shù)的三分之一，西藏牦牛遺傳多樣性的研究對(duì)藏區(qū)人民的生產(chǎn)、生活影響深遠(yuǎn)。通常認(rèn)為，群體中的單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）是衡量一個(gè)群體線粒體DNA 變異程度的兩個(gè)重要指標(biāo)，Hd值和Pi值與遺傳多樣性呈正相關(guān)［17］。本研究中，西藏15個(gè)牦牛類群平均單倍型多樣性（Hd）和平均核苷酸多樣性（Pi）分別為0.2978、0.00191，說明總體上西藏牦牛mtDNAND6基因遺傳多樣性較低。這可能是因?yàn)閙tDNAND6基因編碼蛋白，受到選擇壓力大，進(jìn)化速度慢，變異性小［18］。但在西藏15個(gè)牦牛類群中，類烏齊牦牛無論是單倍型多樣性（Hd）還是核苷酸多樣性（Pi）均顯著高于其他牦牛類群，遺傳多樣性最豐富，同時(shí)類烏齊牦牛也是本研究中多態(tài)位點(diǎn)最多的類群。這可能是因?yàn)轭悶觚R位于西藏東部，交通便利，與周邊地區(qū)交流頻繁，隨著各民族的遷移、融合，導(dǎo)致類烏齊牦牛與各牦牛類群間基因交流增多。此外，本研究中根據(jù)西藏15個(gè)牦牛類群的150個(gè)個(gè)體的序列，共定義出7種單倍型。從單倍型分布情況來看，6種單倍型類型為部分牦牛類群所特有，因此在商品生產(chǎn)或者育種工作中，應(yīng)防止盲目雜交，避免某些優(yōu)良基因的丟失，同時(shí)各級(jí)職能部門應(yīng)加大投入，建立合理的育種制度，以保持西藏牦牛的遺傳多樣性［19］。

3.3 西藏牦牛類群的遺傳分化和系統(tǒng)進(jìn)化

對(duì)西藏牦牛正確的分類一直是學(xué)者們?cè)陉笈Ｑ芯恐械闹攸c(diǎn)和熱點(diǎn)。李鐸等［3］利用微衛(wèi)星標(biāo)記將西藏11個(gè)牦牛類群分為3類，即嘉黎牦牛、帕里牦牛、桑桑牦牛、巴青牦牛、類烏齊牦牛、康布牦牛聚為一類，斯布牦牛、工布江達(dá)牦牛、桑日額牛、江達(dá)牦牛聚為一類，丁青牦牛單獨(dú)成為一類。柴志欣等［4］利用RAPD 標(biāo)記將西藏11個(gè)牦牛類群分為2類，即帕里牦牛（PL）為一類，其余10 個(gè)牦牛類群為另一類。本研究根據(jù)西藏牦牛mtDNAND6基因的遺傳距離，用非加權(quán)平均值法將西藏15個(gè)牦牛類群分為兩類，即類烏齊牦牛聚為一類，其他牦牛類群聚為一類。這種分類結(jié)果不一致可能是因?yàn)闃颖緮?shù)多少和研究手段不同造成。

近年來，多位學(xué)者對(duì)西藏牦牛的母系起源進(jìn)行了研究。鐘金城等［20］通過RAPD 標(biāo)記分析得西藏牦牛可能有2個(gè)母系起源，張成福等［12］也支持這一觀點(diǎn)。本研究中，從單倍型的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，西藏牦牛類群可能有2個(gè)母系來源，支持鐘金城的觀點(diǎn)。但這還不能完全證明西藏牦牛的起源問題，要徹底弄清楚西藏牦牛的起源演化，尚需借助其他分子標(biāo)記技術(shù)以及進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究。

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