徐曉鷗,吳志毅,陳 曦,王有杰,夏 拯

（1.浙江大學(xué),浙江杭州 310058；2.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局,浙江杭州 310016）

2種豆類植物病原細(xì)菌的紅外光譜檢測(cè)與鑒定

徐曉鷗1,2,吳志毅1,2,陳 曦2,王有杰2,夏 拯2

（1.浙江大學(xué),浙江杭州 310058；2.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局,浙江杭州 310016）

菜豆細(xì)菌性暈疫病與豌豆細(xì)菌性疫病是由丁香假單胞桿菌屬（Pseudomonassp.）細(xì)菌引起的2種重要豆科作物細(xì)菌性病害。傳統(tǒng)檢測(cè)方法不僅周期長,且鑒定步驟繁瑣。本研究首次使用紅外光譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)和鑒定,發(fā)現(xiàn)2種病原菌在3000～4000cm-1內(nèi)具有特異性峰位,顯示該方法可行。

菜豆暈疫??；豌豆細(xì)菌性疫??；紅外光譜技術(shù)

菜豆暈疫病是豆科作物一種重要的檢疫性細(xì)菌病害［1-2］,可侵染扁豆,赤豆,木豆,桑橙,多花菜豆,月豆,菜豆,碗豆,葛,野葛,綠豆,豇豆和大豆。盡管很多國家采取了一系列的防御措施,該病害仍以驚人的速度傳播和蔓延,至今已在世界各大洲的60多個(gè)國家和地區(qū)有分布。我國黑龍江地區(qū)也有該病害發(fā)生的記錄。菜豆暈疫病主要通過帶菌種子作遠(yuǎn)距離傳播,在田間則通過風(fēng)雨、灌溉傳播。發(fā)病時(shí)主要侵染葉片,初在葉片或新生葉上現(xiàn)不規(guī)則水浸狀斑點(diǎn),后在斑周圍出現(xiàn)直徑0.5～1.0cm的暈圈,斑上常有菌膿溢出；葉脈染病致葉脈壞死,易穿孔或皺縮畸形；果莢染病初現(xiàn)水浸狀斑點(diǎn),后變褐干縮下陷,斑面滲出菌膿,或病斑中央枯死點(diǎn)小。

豌豆細(xì)菌性疫病與菜豆暈疫病一樣,同是丁香假單胞桿菌屬（Pseudomonassp.）細(xì)菌引起的一種重要豆科作物的細(xì)菌性病害［3-5］,其主要寄主有豌豆、扁豆、香豌豆、野豌豆。該病目前在歐洲、亞洲、美洲、大洋洲均有發(fā)生,但在我國還未見報(bào)道。豌豆細(xì)菌性疫病主要以帶菌種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播,病菌在種子表面或種子內(nèi)部至少可存活10個(gè)月,潛在傳入危險(xiǎn)性較大。所有地上部分的組織受害后表現(xiàn)為壞死斑,其中在莖稈和托葉上的癥狀最明顯。系統(tǒng)侵染可能導(dǎo)致整個(gè)植株萎蔫枯死,侵染花?？梢鸹ê投骨v枯萎,導(dǎo)致植株猝倒,早期侵染可造成嚴(yán)重?fù)p失,對(duì)產(chǎn)量影響較大。

2012年,我國進(jìn)口大豆5838萬t,較2011年增長了10.9%。隨著大豆進(jìn)口量的日益增加,大豆病害進(jìn)入我國的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。紅外光譜檢測(cè)技術(shù)是一種利用物體受到頻率連續(xù)變化的紅外光照射時(shí),分子吸收了某些頻率的輻射,所產(chǎn)生分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的躍遷原理,對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)產(chǎn)生的紅外光譜圖達(dá)到鑒定目的新技術(shù)［6-10］。該技術(shù)目前已在食源性致病菌檢測(cè)鑒定中被應(yīng)用［11-14］。本研究針對(duì)2種豆類植物病原細(xì)菌-菜豆暈疫病菌（Pseudomonassaυastanoipv.phaseolicola）以及豌豆細(xì)菌性疫病菌（Pseudomonassyringaepv.Pisi）進(jìn)行了紅外光譜檢測(cè)鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

豌豆細(xì)菌性疫病菌菌株LMG579和菜豆暈疫病菌菌株LMG2245標(biāo)準(zhǔn)菌株,自于比利時(shí)根特大學(xué)微生物學(xué)試驗(yàn)室（世界菌種協(xié)會(huì)）的惠贈(zèng)。

試驗(yàn)儀器有Nicolet5700紅外光譜儀（美國熱電公司）,氣浴震蕩儀,干燥濃縮儀,培養(yǎng)箱、顯微鏡、離心機(jī)等其他小型儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 干燥菌株制備

將菌株接種至NA培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)12～24h；挑取單菌落接種至NB培養(yǎng)液中,30℃下180r·min-1培養(yǎng)12h,制成種子液,將20μL種子液均勻轉(zhuǎn)接至8mL的NB培養(yǎng)液中,30℃下180r·min-1培養(yǎng)24h；將菌懸液20℃下8000r·min-1離心4min；并用NaCl洗滌3次,得到菌體細(xì)胞,將其放入真空濃縮干燥器中使之完全干燥,每株菌制備2個(gè)干燥菌株樣品。

1.2.2 紅外檢測(cè)流程

以1∶100的比例,將制備好的干燥菌株樣品溴化鉀混合磨碎壓片（100kg·cm-2,1200psi）8 min,用紅外光譜測(cè)定。光譜分辨率為4cm-1,測(cè)量范圍500～4000cm-1,掃描信號(hào)累加32次,自動(dòng)平滑處理,自動(dòng)基線校正,掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除H2O和CO2的干擾,設(shè)不放入樣品的空背景作為背景,每測(cè)一樣品掃描背景1次,每樣品重復(fù)5次,取波普的平均值,光譜得到的數(shù)據(jù)用Grams32軟件分析。

2 結(jié)果與分析

由表1,2可以看出,在500～4000cm-1內(nèi),菌株5079和2245有2個(gè)相同的峰位為3396.36cm-1（3307.66cm-1）和1463.58cm-1（1401.29cm-1）,其吸收帶分別歸屬于O-H伸縮或N-H伸縮振動(dòng)、C-H剪式和彎曲震動(dòng)。另外,3548.21,3545.99,3516.18,3508.02, 3489.27,3473.10和3414.46cm-1為5079菌株所特有,前4個(gè)峰位歸屬于O-H（Monomeric或Hydrogenbonded）伸縮振動(dòng),后3個(gè)歸屬于N-H伸縮振動(dòng)和O-H伸縮振動(dòng)。2926.68,1651.83,1545.29, 1545.10,1241.66和1076.56cm-1的峰位為2245菌株所特有,分別歸屬于C-H伸縮震動(dòng)和OH伸縮振動(dòng)、C=C伸縮振動(dòng)和NO2不對(duì)稱伸縮振動(dòng)、NO2不對(duì)稱伸縮振動(dòng)、NO2不對(duì)稱伸縮振動(dòng)、C-O伸縮振動(dòng)和C-O伸縮振動(dòng)。

表1 豌豆細(xì)菌性疫病菌菌株LMG2245的主要官能團(tuán)及其強(qiáng)度

表2 菜豆暈疫病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LMG2245的主要官能團(tuán)及其強(qiáng)度

3 小結(jié)

用紅外光譜技術(shù)檢測(cè)菜豆暈疫病菌和豌豆細(xì)菌性疫病,結(jié)果顯示,兩菌光譜有明顯差異,光譜結(jié)果特異性強(qiáng),在3000～4000cm-1內(nèi),分別具有特異性峰位,可作為生物標(biāo)記供2種菌的鑒定使用。該方法檢測(cè)周期較短,僅為2h左右,檢測(cè)步驟簡(jiǎn)潔,樣品前處理便捷,具有較好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

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0528-9017（2014）02-0233-02

文獻(xiàn)著錄格式：徐曉鷗,吳志毅,陳曦,等.2種豆類植物病原細(xì)菌的紅外光譜檢測(cè)與鑒定［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（2）：233-235.

2013-10-28

浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（ZK200996x,ZK201310）

徐曉鷗,在職碩士,從事植物檢驗(yàn)檢疫工作。E-mail：xxo@yw.ziq.gov.cn。

吳志毅,博士,高級(jí)農(nóng)藝師,從事植物檢驗(yàn)檢疫工作。E-mail：wzy@ziq.gov.cn。