魯忠富,胡耀文,汪寶根,吳曉花,徐 沛,李國景

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

干旱脅迫下長豇豆莖干持綠性的關聯(lián)分析

魯忠富,胡耀文,汪寶根,吳曉花,徐 沛,李國景

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

利用已建立的快速、準確的長豇豆種質(zhì)苗期耐旱性鑒定技術體系鑒定了我國99份長豇豆微核心種質(zhì)的重要耐旱性指標莖干持綠性。利用覆蓋全基因組的1127個SNP標記進行核心種質(zhì)群體的基因型分析和表型-標記關聯(lián)分析,獲得與莖干持綠性顯著相關的SNP標記4個（P＜10-4）。

長豇豆；耐旱；莖干持綠性；SNP；關聯(lián)分析

豇豆［Vignaunguiculata（L.）Walp］起源于非洲,是重要的豆類作物。長豇豆（V. sesquipedalis）是豇豆的一個重要亞種,廣泛種植于東南亞與中國各地。目前我國長豇豆年栽培面積在20萬hm2以上,主要于夏秋季種植,以采摘嫩莢作為菜用。由于種植季節(jié)正值高溫,干旱成為制約長豇豆生產(chǎn)的重要因素,嚴重影響長豇豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。挖掘、應用長豇豆耐旱基因是解決這一問題的重要手段［1］。

莖干持綠性（Stg）是指植物在遇干旱脅迫時能夠在一定時期內(nèi)保持其莖干葉綠素不被破壞,維持細胞正常生命功能的性狀。該性狀已被證明可作為豇豆、高粱、大麥等作物重要的耐旱性指標,并且具有測定簡便、準確等優(yōu)點［2］。關聯(lián)分析是利用不同基因座等位變異（基因）間的連鎖不平衡關系進行標記與性狀的相關性分析的遺傳學方法,以達到鑒定控制特定性狀基因（或染色體區(qū)段）的目的［3］。連鎖不平衡是指群體內(nèi)不同基因座基因間的非隨機性關聯(lián)。關聯(lián)分析已被廣泛用于動植物重要性狀基因的挖掘、鑒定工作［4］。本研究即利用基于SNP標記的關聯(lián)分析開展豇豆耐旱性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

以我國長豇豆微核心種質(zhì)群體中的99份種質(zhì)為研究材料。

1.2 處理設計

種質(zhì)材料直播于盆缽中,在玻璃溫室中栽培?；|(zhì)為營養(yǎng)土和蛭石（1∶1）的混合物。實驗設置正常對照組2個重復,干旱處理組3個重復。各盆缽中均用量器量取等量基質(zhì)裝填,播種時各播5粒種子,待第1對真葉平展后留取2株健壯一致的幼苗。脅迫處理前每盆缽每次均用等量且過量的水澆透基質(zhì)。干旱處理組播種后18d停止?jié)菜M行脅迫處理,在脅迫后第24d進行莖干持綠性表型觀察。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 基因型測定

DNA提取。取各材料葉片組織0.1g加液氮研磨成粉末,用Qiagene試劑盒參照說明書提取DNA。

基因型測定。用Kaspar豇豆DNA高通量SNP基因分型平臺進行基因型分析,具體方法參考文獻［5］。

1.3.2 莖干持綠性鑒定

將Stg分成0-5級：0級,莖干正常,無失綠；1級,≤20%莖干失綠；2級,20%～40%莖干失綠；3級,40%～60%莖干失綠；4級, 60%～80%莖干失綠；5級：＞80%莖干失綠至完全枯黃［6］。

1.4 關聯(lián)分析

關聯(lián)分析采利用Tassel2.1軟件進行,在混合線性模型（MLM）下進行運算。所用群體的群體結構和親緣關系系數(shù)采用文獻［5］的數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

對正常對照和干旱處理條件下豇豆微核心種質(zhì)群體的Stg調(diào)查結果（圖1）顯示,對照組沒有特征性的統(tǒng)計分布趨勢,其Stg變異主要由品種的葉綠素含量高低造成。而干旱處理組則呈現(xiàn)偏向低值的近正態(tài)分布的特點,表明干旱脅迫處理對多數(shù)植株造成了較重的脅迫,并且群體的Stg分布規(guī)律明顯,適宜進行關聯(lián)作圖分析。表1列出了對照和處理組豇豆微核心種質(zhì)群體莖干持綠性描述統(tǒng)計值。

圖1 正常對照和干旱處理下豇豆微核心種質(zhì)群體的Stg值頻率分布

表1 正常對照和干旱處理下豇豆微核心種質(zhì)群體莖干持綠性描述結果

利用由高通量IlluminaGoldenGateSNP基因型檢測平臺轉(zhuǎn)化而來的KsaparSNP基因型檢測平臺高通量檢測了99份材料1127個SNP位點的基因型。結果表明,有1102個SNP成功檢測到信號,技術成功率為97.7%。1102個SNP中,有8個SNP在群體中缺失信號超過20%,5個SNP在10%以上的材料中為雜合基因型,247個SNP在群體中無多態(tài),420個SNP的次要等位位點頻率值＜0.1。在去除上述低質(zhì)量或低信息量SNP位點后,有422個SNP位點的基因型數(shù)據(jù)被用于連鎖不平衡分析。SNPs在群體中呈雙等位位點和連續(xù)頻率分布,頻率分布峰值在0.1～0.18。

采用Tassel軟件的MLM關聯(lián)分析表明,以Stg為指標能在處理組中檢測到4個顯著性位點（P= 10-4）,但在對照組不能檢測到顯著性位點。顯著性位點及其P值見表2。

根據(jù)文獻［7］,這4個標記中1-1162位點定位于LG3上,其他3個標記位點定位到了普通豇豆整合遺傳圖譜上［8］,其中1-1481和1-1021位點均定位于LG2上且緊密連鎖,1-1286位點定位于LG10上。

表2 利用MLM關聯(lián)分析獲得的顯著性位點（P＜10-4）

3 小結和討論

本研究利用MLM方法檢測到了4個與豇豆莖干持綠性關聯(lián)的SNP位點,這些位點將作為潛在的分子標記位點用于今后的輔助育種。當前的工作正考慮利用傳統(tǒng)QTL定位方法分析這些顯著性位點與耐旱性相關QTL是否存在共定位關系。另外,由于SNP標記在實際育種中不如PCR標記簡便,后續(xù)工作將考慮將SNP標記轉(zhuǎn)化為PCR標記［9］。轉(zhuǎn)化成功后利用轉(zhuǎn)化的PCR標記只需通過檢測豇豆材料的基因組內(nèi)是否存在與控制莖干持綠性的耐熱/旱基因顯著關聯(lián)的特異DNA片段,即可在苗期輔助快速確定該材料是否具對干旱脅迫的耐受性。

在普通豇豆耐旱性研究中,除莖干持綠性外,單葉和第1三出復葉衰老、植株萎蔫程度、三出復葉相對含水量、葉片最大光化學效率等指標也已被用于耐旱性研究。后續(xù)工作中將繼續(xù)開展上述指標與長豇豆耐旱性的關系研究,以期獲得更多與耐旱性關聯(lián)更緊密的標記位點。

［1］ 汪寶根,劉永華,吳曉花,等.干旱脅迫下長豇豆葉綠素熒光參數(shù)與品種耐旱性的關系［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報, 2009,21（3）：246-249.

［2］ MucheroW,EhlersJD,RobertsPA.Restrictionsite polymorphism-basedcandidategenemappingforseedlingdrought toleranceincowpea［Vignaunguiculata（L.）.Walp.］［J］. TheorApplGenet,2010,120（3）：509-518.

［3］ ShuX,BackesG,RasmussenSK.Genome-wideassociationstudy ofresistantstarch（RS）phenotypesinabarleyvarietycollection［J］.JAgricFoodChem,2012,60（41）：10302-10311.

［4］ MucheroW,RobertsPA,DiopNN,etal.Geneticarchitectureof delayedsenescence,biomass,andgrainyieldunderdroughtstress incowpea［J］.PLoSOne,2013,8（7）：e70041.

［5］ XuP,WuX,WangB,etal.Genomewidelinkage disequilibriuminChineseasparagusbean（Vigna.unguiculata ssp.sesquipedialis）germplasm：implicationsfordomestication historyandgenomewideassociationstudies［J］.Heredity, 2012,109（1）：34-40.

［6］ MucheroW,EhlersJD,CloseTJ,etal.MappingQTLfor droughtstress-inducedprematuresenescenceandmaturityin cowpea［Vignaunguiculata（L.）Walp.］［J］.TheorAppl Genet,2009,118（5）：849-863.

［7］ XuP,WuX,WangB,etal.ASNPandSSRbasedgenetic mapofasparagusbean（Vigna.unguiculatassp.sesquipedialis）andcomparisonwiththebroaderspecies［J］.PLoSOne, 2011,6（1）：15952.

［8］ MucheroW,DiopNN,BhatPR,etal.Aconsensusgenetic mapofcowpea［Vignaunguiculata（L）Walp.］andsynteny basedonEST-derivedSNPs［J］.ProcNatlAcadSci,2009, 106（43）：18159-18164.

［9］ LiG,LiuY,EhlersJD,etal.IdentificationofanAFLP fragmentlinkedtorustresistanceinasparagusbeanandits conversiontoaSCARmarker［J］.HortScience,2007,42：1153-1156.

（責任編輯：張才德）

S643.4

A

0528-9017（2014）02-0202-02

文獻著錄格式：魯忠富,胡耀文,汪寶根,等.干旱脅迫下長豇豆莖干持綠性的關聯(lián)分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學,2014（2）：202-203,207

2013-12-18

國家自然科學基金項目（30900985）

魯忠富（1963-）,男,浙江杭州人,實驗師,從事蔬菜育種及新品種推廣工作。E-mail：lzf0522@163.com。

李國景。E-mail：Guojing-li@yahoo.com.cn。