楊宗照

（浙江省杭州市畜牧獸醫(yī)局,浙江杭州 310020）

PRRSV對(duì)I型IFN的調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展

楊宗照

（浙江省杭州市畜牧獸醫(yī)局,浙江杭州 310020）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種病原,在豬體內(nèi)它常以持續(xù)感染的形式存在。干擾素（IFN）特別是I型干擾素在抗病毒方面起重要作用,它的產(chǎn)生主要分為T(mén)LR等幾個(gè)途徑。論文綜述PRRSV對(duì)I型IFN的產(chǎn)生途徑的調(diào)節(jié)作用,即對(duì)TLR依賴性、RIG與MDA5依賴性、JAKSTAT等干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞凋亡途徑的抑制和對(duì)NF-κB的上調(diào)或下調(diào)作用。

IFN；PRRSV；免疫調(diào)節(jié)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬繁殖與呼吸障礙,它在豬體內(nèi)常以持續(xù)感染的形式存在。該病毒基因組為單股正鏈RNA,全長(zhǎng)15 kb,包含ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3～7、ORF5a。其中ORF1a、ORF1b編碼2個(gè)大的多聚蛋白：pp1a、pp1a/b,它們被酶解為14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp）。ORF2a、ORF2b、ORF3～7、ORF5a編碼8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：糖蛋白GP2、E、GP3、GP4、GP5、M、N、ORF5a蛋白［1］。

干擾素（IFN）是機(jī)體抵抗病毒感染的一種重要細(xì)胞因子。通過(guò)對(duì)IFN產(chǎn)生過(guò)程的調(diào)節(jié)是病毒逃避宿主抗病毒感染反應(yīng)的一種途徑。

1 干擾素的分類和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

IFN通常分為I、II型。I型是其中起抗病毒作用的主力,并分為許多亞型。人I型IFN分為IFN-α、IFN-β、-ω、-κ、-ε。II型干擾素只有IFN-γ。最近還發(fā)現(xiàn)了III型干擾素,IFN-λ。IFN的產(chǎn)生需要一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,刺激IFN的轉(zhuǎn)錄表達(dá),最終產(chǎn)生IFN蛋白。這些途徑最初步驟需要病原等異物上的配體與宿主細(xì)胞上的受體相互識(shí)別。受體主要有Toll樣受體（TLR）、視黃酸（維甲酸）誘導(dǎo)基因蛋白I（RIG-I）樣受體,前者分布在一些細(xì)胞和細(xì)胞器的表面,后者分布在細(xì)胞質(zhì)中。TLR又分為13種,其中TLR3、-7、-8、-9對(duì)于控制病毒感染的作用最大,不同的受體識(shí)別不同的抗原。

I型干擾素的產(chǎn)生主要分為4條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［2］：TLR3依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；TLR4依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；TLR7、-9依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；RIG-I和MDA-5（黑色素瘤分化相關(guān)蛋白）依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些途徑的差別主要在起始階段。

2 PRRSV對(duì)干擾素產(chǎn)生途徑的調(diào)節(jié)

PRRSV感染后以一種低病毒含量的形式持續(xù)存在,在持續(xù)感染后期,病毒復(fù)制被限制在淋巴組織和其他一些免疫器官如扁桃體、淋巴結(jié)等,也可以在公豬精子中持續(xù)存在。病毒持續(xù)存在一般與免疫反應(yīng)過(guò)差有關(guān),包括中和抗體的產(chǎn)生和先天性免疫反應(yīng)。

在PRRSV感染后豬沒(méi)有典型的I型IFN反應(yīng),感染豬的IFN-α含量很低。盡管肺泡內(nèi)PRRSV復(fù)制比較活躍,但是IFN-α在感染豬的肺內(nèi)檢測(cè)不出來(lái)。IFN的抑制在MARC-145和豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）上表現(xiàn)也很明顯,PRRSV抑制IFN主要是抑制了RIG-I途徑中的IPS-1（干擾素啟動(dòng)子促進(jìn)因子-1）［3］。

2.1 PRRSV與TLR

TLR3、TLR7對(duì)PRRSV比較重要。TLR3在腎、十二指腸、脾、肝中高度表達(dá),而TLR7在骨髓、腸、脾、肝、肺、腸系膜淋巴結(jié)、氣管、胸腺、腎臟和皮膚中適度表達(dá)。TLR9在豬派伊爾小結(jié)中表達(dá),單核樹(shù)突狀細(xì)胞中也可以表達(dá)。在沒(méi)有刺激的情況下,PAM細(xì)胞TLR3、TLR7、TLR8表達(dá)量比骨髓來(lái)源的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（immaturedendriticcells,imDC）高。poly（I：C）刺激PAM可以促進(jìn)TLR3表達(dá),但是抑制TLR7、TLR8的表達(dá)。PRRSV在感染imDC細(xì)胞6h時(shí)下調(diào)TLR3、TLR7、TLR8,在24hpi后恢復(fù)正常［4］。有研究表明,在MARC-145上,用雙鏈RNA激發(fā)TLR3大量表達(dá)則PRRSV被抑制,相反用小干擾RNA抑制TLR3的表達(dá)增加了PRRSV的感染量,可見(jiàn)TLR3對(duì)于抗PRRSV感染有重要作用。

2.2 PRRSV與RIG、MDA5途徑

PRRSV可以激發(fā)NF-κB和AP-1,但是不激發(fā)IRF-3（干擾素調(diào)節(jié)因子3）,顯著阻止合成的雙鏈RNA誘導(dǎo)的IFN-β。進(jìn)一步的試驗(yàn)表明,PRRSV感染顯著滅活I(lǐng)PS-1（RIG-I的配體）；相比而言PRRSV感染只是部分降低了TRIF（TLR3的特異性銜接蛋白）,說(shuō)明PRRSV對(duì)RIG途徑的影響很大［3］。

PRRSV的4種Nsp有抑制活力：Nsp1、Nsp2、Nsp4、Nsp11。Nsp1含有最強(qiáng)的抑制IFN-β啟動(dòng)子的能力,其抑制機(jī)制部分上是由于它促進(jìn)核內(nèi)CBP（CREB結(jié)合蛋白）的降解,抑制了IRF3與CBP的結(jié)合,這樣破壞了IFN的轉(zhuǎn)錄。

Nsp2也下調(diào)I型IFN,Nsp2是個(gè)膜錨定蛋白,含有半胱氨酸蛋白酶（CP）活力和一種解離活力, CP活力抑制了IRF3磷酸化和核移位,解離活力是它對(duì)ISG和NF-κB有作用。

Nsp11也參與了RIG-I信號(hào)抑制,與Nsp1存在于胞漿和核仁不同的是,Nsp11的表達(dá)主要在胞漿,表明它的主要功能在胞漿。Nsp11含有一個(gè)叫做NendoU結(jié)構(gòu)域,有內(nèi)切酶功能。NendoU包含有2個(gè)亞基,A和B。A為功能基, B為維持Nsp11構(gòu)象的基團(tuán)。Nsp11阻止了IRF3和Iκ-B的磷酸化,這導(dǎo)致IRF3和NF-κB核轉(zhuǎn)移的抑制,從而IFN的產(chǎn)生被抑制。在Nsp11表達(dá)的細(xì)胞和PRRSV感染細(xì)胞內(nèi)IPS-1被降解了,這很可能是Nsp11對(duì)IRF3和NF-κB起作用的基礎(chǔ)。（圖1）。

圖1 PRRSV對(duì)IFN產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用

2.3 PRRSV與NF-κB

2.3.1 上調(diào)NF-κB

NF-κB不但在免疫方面起作用,還調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生存。病毒往往阻止NF-κB的激活來(lái)逃避宿主免疫,但是有研究表明在PRRSV感染后36～48 hNF-κB會(huì)上調(diào),其作用與活病毒含量、復(fù)制相關(guān)。因?yàn)樽贤饩€滅活不會(huì)上調(diào)此反應(yīng),PRRSV感染豬漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞后再用豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）刺激與只用TGEV刺激相比PRRSV促進(jìn)了NF-κB的磷酸化。NF-κB被激活可能會(huì)有利于使病毒復(fù)制和宿主細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控達(dá)到一種平衡狀態(tài)［5］。

PRRSVN蛋白可以激活NF-κB,并呈現(xiàn)劑量依賴性,N蛋白30～73處氨基酸是激活NF-κB作用功能區(qū),并分布著核定位區(qū)和核仁定位區(qū),核定位區(qū)對(duì)N形成同源二聚體也很重要,N-N二聚體可以嵌入NF-κB激活結(jié)構(gòu)域中,這意味著N-N二聚體可能與NF-κB激活相關(guān)。

2.3.2 Nsp1α、Nsp2對(duì)NF-κB的下調(diào)作用

Nsp1α能夠抑制NF-κB的激活。Nsp1α可以抑制Iκ-Bα的磷酸化,阻止TNFα引起的NF-κB核轉(zhuǎn)移。Nsp1α是Nsp1的N端,含有木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（PCP酶）的結(jié)構(gòu)域。Shi等［6］通過(guò)點(diǎn)突變證實(shí)了Zn指結(jié)構(gòu)是抑制IFN-β所必需的。Nsp1α缺失C末端14個(gè)氨基酸后（這樣第2個(gè)Zn指也缺失了）,顯示不能抑制IFN,因此結(jié)果顯示Nsp1αZn指結(jié)構(gòu)很可能參與NF-κB途徑的抑制。

Nsp2的卵巢腫瘤（ovariantumor,OUT）結(jié)構(gòu)域能夠解離泛素或從底物中解離ISG15,因?yàn)榉核鼗cRIG-1和TLR信號(hào)有關(guān),像配體蛋白的召集、Iκ-Bα的降解。Nsp2很可能通過(guò)它的OTU區(qū)抑制I型IFN的產(chǎn)生。Nsp2可以干擾磷酸化的Iκ-B多聚泛素化,引起Iκ-B降解失敗,從而下調(diào)NF-κB。

2.4 PRRSV抑制JAK-STAT和ISG途徑

PRRSV抑制I型IFN信號(hào)不只是在IFN產(chǎn)生期,而且是包括IFN分泌后。在MARC-145細(xì)胞內(nèi),在用ISG15、ISG56mRNA作為指示物顯示,感染PRRSV24h后JAK-STAT路徑被抑制, PRRSV阻止了ISGF3移到核內(nèi)。TGEV刺激pDC,發(fā)現(xiàn)STAT1的核轉(zhuǎn)移被PRRSV抑制了,起作用的是Nsp1β（不是Nsp1α）,它抑制了STAT1的磷酸化和ISGF3的核轉(zhuǎn)移。抑制ISGF3的核轉(zhuǎn)移是因?yàn)镹sp1β導(dǎo)致了karyopherin-α1（KPNA1）的降解［7］。ISG15是個(gè)泛素樣分子,可以可逆地與蛋白結(jié)合介導(dǎo)先天性抗病毒免疫。Nsp2OTU結(jié)構(gòu)域有去泛素樣活力,OTU可以水解ISG15,阻止ISG15干擾素調(diào)節(jié)功能。

綜合起來(lái),在PRRSV感染的早期,Nsp1、2、11促進(jìn)病毒基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯,同時(shí)抑制I型IFN的產(chǎn)生和IFN的誘導(dǎo)途徑。在病毒感染后期（36～48hpi）,NF-κB路徑被激活來(lái)有利于病毒在宿主體內(nèi)的持續(xù)存在。

2.5 凋亡和病毒

IFN與其他細(xì)胞因子一起防御著機(jī)體,在這個(gè)過(guò)程中也伴隨著宿主細(xì)胞程序性死亡和體內(nèi)病毒量的減少。凋亡細(xì)胞在PRRSV感染豬的組織中已經(jīng)檢出,但也有研究表明凋亡細(xì)胞不感染PRRSV。有報(bào)道GP5蛋白誘導(dǎo)凋亡是通過(guò)作用于Bcl-2的下游起作用。凋亡功能區(qū)位于GP5蛋白N端（有119個(gè)氨基酸）。還有研究提出旁觀者細(xì)胞發(fā)生凋亡,因?yàn)楦鶕?jù)微陣列法發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比PRRSV感染只是促進(jìn)了極小的促凋亡基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生。使用豬肺泡巨噬細(xì)胞和單核來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞顯示是病毒感染的時(shí)期決定了PRRSV感染細(xì)胞是走向凋亡還是抑制凋亡,感染后8h傾向于抗凋亡,但是所有的感染細(xì)胞最終凋亡和壞死而死亡。病毒蛋白的表達(dá)是誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗凋亡作用的必需因素。非結(jié)構(gòu)蛋白可能也參與其中,因?yàn)樵诰奘杉?xì)胞中結(jié)構(gòu)蛋白能檢出前抗凋亡效果已經(jīng)存在［8］。I型IFN產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡都是機(jī)體對(duì)抗病毒的防御機(jī)制,并有一些共同途徑,因此PRRSV可能主動(dòng)干擾凋亡,部分機(jī)制可能是由于它抑制了I型IFN的產(chǎn)生,尤其是在PRRSV感染的早期階段。

IPS-1是I型IFN誘導(dǎo)和細(xì)胞凋亡的共同步驟,它既能導(dǎo)致I型IFN表達(dá),也能與線粒體作用,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Nsp11能降解IPS-1mRNA,從而引起I型IFN誘導(dǎo)的抑制,但還不知道IPS-1降解是否也抑制細(xì)胞凋亡。SARS-CoVNsp15（PRRSV Nsp11內(nèi)切酶的同源物）,可以抑制IPS-I誘導(dǎo)的凋亡,推測(cè)PRRSVNsp11也可抑制凋亡。

3 小結(jié)與展望

先天免疫尤其是I型IFN信號(hào)路徑是宿主對(duì)抗病毒感染的第一道防線,PRRSV通過(guò)對(duì)IFN多個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)（包括調(diào)控TLR、IRG-I及JAKSTAT介導(dǎo)的I型IFN產(chǎn)生的信號(hào)路徑及凋亡）來(lái)達(dá)到利于其在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)的目的。N蛋白顯示激活NF-κB路徑,這與它的核定位功能、二聚體化有關(guān)。Nsp1、2、11與病毒干擾免疫調(diào)節(jié)有關(guān),它們生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)域或基序也有了研究。Nsp1在核內(nèi)干擾IRF3介導(dǎo)的IFN的產(chǎn)生,在胞漿中干擾NF-κB路徑。Nsp1亞單位Nsp1β通過(guò)在不同細(xì)胞類型中封閉不同的反應(yīng)步驟抑制JAK-STAT路徑。Nsp2通過(guò)其PCP2活性封閉了IRF3的活化,抑制Iκ-B降解,通過(guò)OTU結(jié)構(gòu)域減少泛素化和ISG化。Nsp11通過(guò)NendoU結(jié)構(gòu)域降解IPS-1 mRNA,阻止下游IRF3和NF-κB的活化。GP5蛋白促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。

高致病性藍(lán)耳病毒株感染豬PAM細(xì)胞中TLR3、7、8mRNA的量比普通毒株明顯升高［9］。用pDC細(xì)胞,不同的PRRSV分離株在對(duì)下調(diào)IFN的能力不同［10］。如在不同的細(xì)胞類型上,誘導(dǎo)IFN-β有明顯的差異。長(zhǎng)白豬上來(lái)源的PAM與其他品種豬相比抑制或者延遲了PRRSV的生長(zhǎng)。

PRRSV毒力與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系比較復(fù)雜導(dǎo)致控制該病比較困難,IFN活性調(diào)節(jié)位點(diǎn)的鑒別和使用突變的PRRSV感染性克隆來(lái)去除該病毒引起的免疫抑制功能也許是研制更加有效PRRSV疫苗的途徑之一。

［1］ DeaS,GagnonCA,MardassiH,etal.Currentknowledgeonthe structuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome（PRRS）virus：ComparisonoftheNorthAmericanandEuropean isolates［J］.ArchVirol,2000,145（4）：659-688.

［2］ 徐歆,余東游,李衛(wèi)芬.I型干擾素誘生機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,32（10）：824-828.

［3］ LuoR,XiaoS,JiangY,etal.Porcinereproductiveand respiratorysyndromevirus（PRRSV）suppressesinterferon-beta productionbyinterferingwiththeRIG-Isignalingpathway［J］. MolImmunol,2008,45（10）：2839-2846.

［4］ ChaungHC,ChenCW,HsiehBL,etal.Toll-LikeReceptor expressionsinporcinealveolarmacrophagesandDendriticCells inrespondingtopolyICstimulationandporcinereproductive andrespiratorysyndromevirus（PRRSV）infection［J］.Comp ImmunolMicrobiolInfectDis,2010,33（3）：197-213.

［5］ Calzada-NovaG,SchnitzleinWM,Husmann,RJ,etal. NorthAmericanporcinereproductiveandrespiratorysyndrome virusesinhibittypeIinterferonproductionbyplasmacytoid dendriticcells［J］.JVirol,2011,85（6）：2703-2713.

［6］ ShiX,ZhangX,WangF,etal.Thezinc-fingerdomainwas essentialforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus nonstructuralprotein-1αtoinhibittheproductionofinterferon-β［J］.JInterferonCytokineRes,2013,33（6）：328-334.

［7］ WangR,NanY,YuY,etal.Porcinereproductiveand respiratorysyndromevirusNsp1βinhibitsinterferon-activated JAK/STATsignaltransductionbyinducingkaryopherin-α1 degradation［J］.JVirol,2013,87（9）：5219-5228.

［8］ CostersS,LefebvreDJ,DelputtePL,etal.Porcine reproductiveandrespiratorysyndromevirusmodulatesapoptosis duringreplicationinalveolarmacrophages［J］.ArchVirol, 2008,153（8）：1453-1465.

［9］ ZhangL,LiuJ,BaiJ,etal.ComparativeexpressionofTolllikereceptorsandinflammatorycytokinesinpigsinfectedwith differentvirulentporcinereproductiveandrespiratorysyndrome virusisolates［J］.VirolJ,2013,10（1）：135.

［10］ BaumannA,MateuE,MurtaughMP,etal.Impactof genotype1and2ofporcinereproductiveandrespiratory syndromevirusesoninterferon-αresponsesbyplasmacytoid dendriticcells［J］.VetRes,2013,44（1）：33.

（責(zé)任編輯：盧福莊）

S852

A

0528-9017（2014）02-0281-03

文獻(xiàn)著錄格式：楊宗照.PRRSV對(duì)I型IFN的調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（2）：281-283,287.

2013-12-18

楊宗照（1973-）,男,河南南召人,高級(jí)獸醫(yī)師,主要從事動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室診斷與研究工作。