方文清，董昌平

(1. 福建生物工程職業(yè)技術學院，福建 福州 350002; 2. 福建省南平市藥品檢驗所，福建 南平 353000)

虎杖為廖科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc. 的干燥根莖和根，具有祛風除濕、清熱解毒等功效，用于治療風濕痹痛、痰多咳嗽、跌打損傷等癥。據(jù)調查，市場出售的虎杖藥材來源地較多。本研究參考相關規(guī)定[1-6]測定了不同產(chǎn)地虎杖中虎杖苷和總黃酮的含量，為評價虎杖質量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100 型高效液相色譜儀;UV2401 型紫外分光光度計(日本島津公司);KQ3200E 型超聲儀;XS205DU 型電子天平;Millipore 超純水器(梅特勒公司)。樣品經(jīng)福建省藥品檢驗所胡敏老師鑒定為廖科植物虎杖。虎杖苷對照品(批號為111575 -200502)和蘆丁對照品(批號為100080-200707，含量為92.5%)，均購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈為色譜純，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸、乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 虎杖苷含量測定(高效液相色譜法)

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-1%磷酸(50 ∶50);檢測波長:306 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。在此條件下，虎杖苷與樣品中其他成分達到基線分離，見圖1。

2.1.2 溶液制備

稱取虎杖苷對照品16.98 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，制得對照品貯備液(1.698 0 g/L 虎杖苷)。精密吸取對照品貯備液1 mL，置10 mL 容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液(含0.169 8 g/L 虎杖苷)。取樣品細粉約0.8 g，置100 mL 錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定質量，回流30 min，取出，冷卻，用60%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.3 方法學考察

線性關系考察:取對照品溶液，分別依法進樣1，2，5，10，20 μL，記錄色譜圖。以峰面積(Y)為縱坐標、進樣量(X)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=3 153.541 X-18.423，r=0.996 6(n=5)。結果表明，虎杖苷進樣量在0.169 8 ～3.396 0 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:取同一對照品溶液，重復進樣5 次，每次10 μL。結果虎杖苷峰面積的RSD 為0.13%(n =5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液及對照品溶液，分別于0，1，2，4，8，12 h 時進樣測定。結果供試品溶液中虎杖苷峰面積的RSD為0.85%(n=6)，對照品溶液中虎杖苷峰面積的RSD 為0.67%(n=6)，表明供試品溶液與對照品溶液在12 h 內穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一批樣品，按擬訂方法平行制備供試品溶液6 份，進樣測定。結果虎杖苷峰面積的RSD 為1.19%(n=6)，表明該方法重復性良好。

回收率試驗:取已知含量的樣品約0.4 g，加入對照品貯備液2 mL，按擬訂方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 虎杖苷加樣回收試驗結果( n=5)

2.1.4 樣品含量測定

取各樣品粉末約0.8 g，按擬訂方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果見表2。

表2 不同產(chǎn)地虎杖藥材含量測定結果( n=3)

2.2 總黃酮含量測定(紫外分光光度法)

2.2.1 溶液制備

稱取蘆丁對照品50.52 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，即得對照品貯備液(含4.673 1 g/L 蘆丁)。精密吸取對照品貯備液1 mL，置25 mL 容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液(含0.186 9 g/L)。取細粉約0.2 g，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質量，回流30 min，放冷，用70%乙醇補足減失的質量，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.2 方法學考察

標準曲線制備:精密吸取對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置25 mL 容量瓶中，加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加5%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液4 mL，再加70%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以70%乙醇為空白，在500 nm 波長下測定吸光度值，以吸光度值(Y)為縱坐標、質量濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=20.642 X+0.013 5，R2=0.999 7(n=6)，見圖2。

圖2 蘆丁對照品標準曲線

精密度試驗:精密吸取對照品溶液3.0 mL，置25 mL 容量瓶中，依法測定吸光度值，重復進樣測定6 次。結果吸光度值的RSD為0.12%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液1 mL，按擬訂方法置25 mL 容量瓶中，依法測定，間隔時間5 min。結果吸光度值的RSD 為1.96%(n=6)，表明供試品溶液在30 min 內穩(wěn)定。

重復性試驗:取同一樣品5 份，按擬訂方法制備供試品溶液，精密吸取1.0 mL，置25 mL 容量瓶中，依法測定吸光度值。結果平均含量為10.96%，RSD 為1.90%(n=5)，表明方法重復性良好。

回收率試驗:取已知含量的樣品5 份，每份0.1 g，精密稱定，分別精密加入對照品貯備液2.3 mL，按擬訂方法制備供試品溶液，精密吸取1 mL，置25 mL 容量瓶中，依法測定吸光度值。結果見表3。

表3 總黃酮加樣回收試驗結果( n=5)

2.2.3 樣品含量測定

取各樣品粉末約0.2 g，按擬訂方法制備供試品溶液，精密吸取1 mL，置25 mL 容量瓶中，依法測定吸光度值。結果見表2。

3 討論

虎杖苷的含量測定中，考察了索氏提取、回流提取、超聲提取方法[2-3，6]，結果前兩者的虎杖苷含量高且較接近，超聲提取的含量低，為了節(jié)約時間且操作簡便，選擇回流法作為提取方法;考察了不同的乙醇比例對提取含量的影響，結果顯示，60%乙醇提取的虎杖苷含量高;考察了回流時間，結果30 min 時虎杖苷含量提取已達最高。

總黃酮的含量測定中，考察了回流提取、超聲提取方法，結果回流提取的含量明顯高于超聲提取;考察了不同提取溶劑，60%，70%，80%，90%甲醇與50%，60%，70%，80%乙醇，結果70%甲醇與60%乙醇的提取效果最好，乙醇低毒低價，故選擇60%乙醇作為提取溶劑;考察了回流時間，結果30 min 時總黃酮含量提取已達最高，故選擇提取時間為30 min。

不同產(chǎn)地虎杖的虎杖苷和總黃酮含量差異較大，其中四川綿陽產(chǎn)的最高，浙江舟山和福建福州產(chǎn)的最低。

本研究中的測定方法操作簡便、準確、可靠、重復性好，為虎杖質量評價提供了可靠依據(jù)。

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