袁曉慧等

摘要[目的]優(yōu)化簡(jiǎn)易-高鹽沉淀法提取云南松針葉DNA的條件。[方法]采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)簡(jiǎn)易-高鹽沉淀法提取云南松針葉基因組DNA的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，然后用濃度1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA溶液的純度和濃度，以定性和定量檢測(cè)為指標(biāo)，得出簡(jiǎn)易-高鹽沉淀法提取云南松針葉基因組DNA的最佳處理組合。[結(jié)果]最佳處理組合為：水浴溫度為70 ℃，V氯仿∶V異戊醇=25∶1，離心時(shí)間為8 min，NaCl濃度為2.2 mol/L。[結(jié)論]該結(jié)果可為開(kāi)展云南松分子生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 云南松（Pinus yunnanensis）；正交試驗(yàn)；簡(jiǎn)易-高鹽沉淀法

中圖分類號(hào) S791.24 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）15-04564-02

Abstract [Objective] To optimize conditions for extracting DNA from Pinus yunnanensis needles by simple-high salt precipitation. [Method] Using orthogonal test， the extraction conditions were optimized. Then， 1% of agarose gel electrophoresis was used to detect the quality of the DNA and micro-ultraviolet spectrophotometer was used to detect the purity and concentration of the DNA. The best processing combination that extracting DNA from P. yunnanensis needles by simple-high salt precipitation was decided by qualitative and quantitative indexes. [Result] It is concluded that the optimal combination were as follows： Vchloroform∶Visoamylol=25∶1， NaCl concentration is 2.2 mol/L， pyrolysis temperature is 70 ℃ and the centrifuge time is 8 min. [Conclusion] The results will lay a foundation for further research of P. yunnanensis in molecular biology.

Key words Pinus yunnanensis； Orthogonal design； Simple-high salt precipitation

云南松（Pinus yunnanensis）是分布于我國(guó)西南季風(fēng)影響下的亞熱帶山地暖性氣候條件下的重要樹(shù)種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐干旱瘠薄以及木材用途廣泛等特點(diǎn)[1]，是我國(guó)西南特有種，也是組成滇黔桂亞熱帶山地針葉林植被的主要成分之一。其面積、蓄積量分別占云南省有林地面積、蓄積量的29.2%和15.8%，在云南林業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位，對(duì)生態(tài)經(jīng)濟(jì)建設(shè)也具有舉足輕重的作用[2]。

高質(zhì)量的基因組DNA是進(jìn)行云南松遺傳多樣性研究及其他相關(guān)分子生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)，是研究云南松種質(zhì)資源、調(diào)查云南松基因多樣性以及制定有效保護(hù)措施的前提。云南松針葉中含有較多的松脂（萜烯類化合物）和酚類等次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)容易與基因組DNA形成復(fù)合物，導(dǎo)致高純度的DNA的提取相對(duì)比較困難。將簡(jiǎn)易提取法所得DNA充分溶解于TE后，再經(jīng)過(guò)高鹽沉淀法的進(jìn)一步處理，可有效去除多糖和其他次生代謝雜質(zhì)，獲得可滿足試驗(yàn)要求的高質(zhì)量的DNA[3]。筆者采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4]，對(duì)簡(jiǎn)易-高鹽沉淀法提取云南松針葉基因組DNA的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并以定性和定量檢測(cè)為指標(biāo)，從而得出簡(jiǎn)易-高鹽沉淀法提取云南松針葉基因組DNA的最佳處理組合，以期為云南松分子水平的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。云南松針葉，采集于云南省昆明市西南林業(yè)大學(xué)格林溫室內(nèi)種植的云南松新鮮幼嫩的針葉。

1.1.2 主要儀器。Beckman Avanti-30高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自北京時(shí)代北利離心機(jī)廠；Synoptics Genegenius凝膠成像分析儀和Bio-Rad Pac-300電泳儀，購(gòu)自Bio-Rad公司；微量紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自上海元析儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑。Tris和PVP，購(gòu)自Sigma公司；β-巰基乙醇，購(gòu)自Amresco公司；CTAB，購(gòu)自Solarbio公司；TE緩沖液，購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；DL2000 Marker和Loading buffer，購(gòu)自TaKaRa公司；100 mmol/L Tris-HCL（pH 8.0）、1.4 mmol/L NaCl、20 mmol/L、EDTA、2%CTAB、3% PVP、3%β-巰基乙醇、氯仿、異戊醇、TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCL，pH 8.0；0.1 mmol/L EDTA）和無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 材料的采集及保存。隨機(jī)采集云南松當(dāng)年生嫩針葉，平均分成16份，分別放入自封袋中，加入標(biāo)簽，擠壓出自封袋內(nèi)的空氣，置于-20 ℃的冰箱中保存。

1.2.2 DNA的提取。DNA提取的因素水平表見(jiàn)表1，設(shè)置水浴溫度、離心時(shí)間、V氯仿∶V異戊醇、NaCl濃度4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置4個(gè)水平。提取步驟如下：①?gòu)谋渲腥〕霰４娴脑颇纤舍樔~樣品，取適量針葉放入研缽中，往研缽中迅速加入液氮研磨（液氮沒(méi)過(guò)針葉，一邊研磨一邊不斷加入液氮），充分研磨至細(xì)粉末狀后，迅速裝入2 ml離心管中（裝到1/3處）；②迅速往離心管中加入50 μl β-巰基乙醇和預(yù)熱（水浴溫度）的DNA提取液至刻度處，充分搖勻，放入水浴鍋中保溫50 min，期間每隔10 min搖勻1次；③將離心管放入預(yù)冷（-4 ℃）的超速離心機(jī)中離心；④取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇，充分混勻后，將離心管放入預(yù)冷（-4 ℃）的超速離心機(jī)中離心；⑤重復(fù)步驟“

④”2次后，取上清液，加入2.5倍體積預(yù)冷（-20 ℃）的無(wú)水乙醇；⑥在冰箱中靜置過(guò)夜后，將離心管放入預(yù)冷預(yù)冷（-4 ℃）的超速離心機(jī)中離心，倒掉上清液（注意不要將白色絮狀物倒掉）；⑦將所得沉淀用濃度70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于100 μl的TE中；⑧加入適量的NaCl溶液，使溶液中NaCl的終濃度達(dá)到所定標(biāo)準(zhǔn)，然后再次用無(wú)水乙醇將DNA沉淀出來(lái)，經(jīng)洗滌風(fēng)干后，溶于100 μl的TE緩沖液中。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)。待用TE緩沖液溶解的DNA解凍后，用濃度1%瓊脂糖凝膠在120 V 恒壓下電泳40 min。電泳結(jié)束后在GeneGenins 公司的Bio Imaging System 上觀測(cè)并拍照和分析。結(jié)果統(tǒng)計(jì)參照何正文等[5]的方法，依擴(kuò)增條帶的敏感性和特異性（即條帶強(qiáng)弱及雜帶的多少）計(jì)分，分?jǐn)?shù)越高，表示DNA含量越高，所含雜質(zhì)越少。

1.2.4 DNA的純度和濃度檢測(cè)。用微量紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定OD260值、OD280值、OD260/OD280值，以此檢測(cè)DNA的質(zhì)量，計(jì)算DNA濃度，若OD260/OD280值為1.7～1.9，表明DNA雜質(zhì)污染較小，純度較好[6]；若比值>1.9，則表明存在RNA的污染；若比值<1.6，則表明有蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)的影響[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南松針葉DNA的質(zhì)量

將圖1中條帶的強(qiáng)弱及雜帶的多少對(duì)16 個(gè)處理組合進(jìn)行打分，即條帶數(shù)量豐富、清晰度高、背景低的產(chǎn)物記為16 分，而最差的記為1 分。圖中1～16 處理組合計(jì)分分別為：13、9、14、11、12、7、9、6、7、16、7、12、5、3、11、15，并對(duì)不同因素與水平的電泳評(píng)分平均值和極差進(jìn)行計(jì)算分析，結(jié)果如表3所示。

3 結(jié)論與討論

提取高質(zhì)量的DNA是現(xiàn)代生物技術(shù)研究中分子生物學(xué)試驗(yàn)的第一步，也是關(guān)鍵的一步[8]，雖然采用試劑盒提取比較快捷，但價(jià)格昂貴[9]。正交設(shè)計(jì)篩選具有正交的均衡分散、綜合可比及可伸縮、效應(yīng)明確等特性，在減少試驗(yàn)規(guī)模的同時(shí)又不損失信息，能快速找到最優(yōu)組合，同時(shí)可分析不同因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度[10-11]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)于多因素、多水平的試驗(yàn)具有簡(jiǎn)便、節(jié)省試驗(yàn)單元且統(tǒng)計(jì)效率高等特點(diǎn)。