李 明 譚詩(shī)云

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢 430060

研究表明，非甾體類消炎藥（non-steroid anti-in-flammatory drugs，NSAIDs）能降低結(jié)腸癌的發(fā)生，減少家族性結(jié)腸息肉患者息肉數(shù)量和大小，并能預(yù)防結(jié)腸腺瘤的復(fù)發(fā)[1]。本室前期研究顯示[2]乙酰水楊酸能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系環(huán)氧合酶-2（COX-2）表達(dá)而抑制生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 但臨床研究表明長(zhǎng)期應(yīng)用NSAIDs可引起胃潰瘍甚至胃出血及一系列心血管不良反應(yīng)，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。 因此尋找毒性小，而又能有效的抑制COX-2 的抑制劑， 是大腸癌化學(xué)預(yù)防的重要課題。

丹皮酚具有與非甾體類抗炎藥相似的藥理作用，包括解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中樞抑制作用等，且其副作用小。 課題組前期[3-5]觀察了丹皮酚對(duì)大腸癌HT-29 細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的影響，發(fā)現(xiàn)丹皮酚可抑制大腸癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)， 調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因如Bcl-2、Bax、Fas 及p53 等的表達(dá)，且丹皮酚能夠影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，并與5-Fu 具有協(xié)同作用。丹皮酚與非甾體類抗炎藥均能有效下調(diào)COX-2 的表達(dá)量， 從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了丹皮酚對(duì)人結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量及RUNX-3 基因的影響。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)； 丹皮酚注射液購(gòu)于寧波天真制藥有限公司，純度≥99.9%；AnnexinV/PI 試劑盒購(gòu)于BENDER 公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清、DMEM/F12 培養(yǎng)基、DEPC 購(gòu)于杭州四季青生物材料研究所；Fluo-3/AM 購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；Trizol 試劑、DEPC、異丙醇、氯仿、RT-PCR 試劑盒等購(gòu)于武漢谷歌生物技術(shù)有限公司；RUNX-3 單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司；辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG 購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

LoVo 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 天傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8 比色法檢測(cè)丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞活力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo 細(xì)胞，以5×104/mL 的濃度接種于96 孔板，每孔200 μL，待細(xì)胞貼壁后分組，丹皮酚組加入丹皮酚終濃度分別為15.63、31.25、62.50、125、250 mg/L 的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液。 每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，實(shí)驗(yàn)終止前2 h 每孔加入CKK-8 試劑20 μL，孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光值，即A 值，細(xì)胞存活率=處理組A 值/對(duì)照組A 值×100%。

1.4 細(xì)胞形態(tài)的觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LoVo 細(xì)胞消化傳代并培養(yǎng)24 h后，換丹皮酚終濃度為15.63～250 mg/L 的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞凋亡率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo 細(xì)胞， 以1×106/mL 濃度接種于6 孔培養(yǎng)板中， 貼壁后分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入含丹皮酚（終濃度為31.25、62.50、125 mg/L）的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，離心、洗滌、固定后加入AnnexinV-FITC和PI 染色。 篩網(wǎng)過(guò)濾送流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo 細(xì)胞，以1×106/mL 接種于特制培養(yǎng)皿中，分組及處理同上，培養(yǎng)48 h 后，HBSS液洗滌3 次， 加入濃度為5 μmol/L 的Fluo-3/AM 工作液300 μL，孵育60 min，用HBSS 液洗滌3 次，加入HBSS 液覆蓋細(xì)胞，孵育30 min。 置于激光掃描共聚焦顯微鏡上檢測(cè)，隨機(jī)選取5 個(gè)視野（放大100倍），每個(gè)視野隨機(jī)選取7 個(gè)細(xì)胞，利用隨機(jī)軟件測(cè)定其熒光強(qiáng)度。 其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度成正相關(guān)，可準(zhǔn)確反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。

1.7 RT-PCR 法檢測(cè)丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞RUNX-3 mRNA 的影響

細(xì)胞接種及分組同上，培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，按Trizol 試劑說(shuō)明書(shū)一步法提取總RNA， 計(jì)算出RNA 濃度，按RT 試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA，并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。 PCR 反應(yīng)條件：94℃4min；94℃30 s，51℃30 s，72℃25 s；30 cycles，72℃4 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳， 紫外光下觀察并拍照。 RT-PCR 采用的β-actin 及RUNX3引物由南京金瑞斯合成，RUNX3 上游引物為5'-CAGAAGCTGGAGGACCAGAC-3'，下游引物為5'-TCGGAGAATGGGTTCAGTTC-3'，β-actin 上游引物為5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'， 下游引物為5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為179 bp 和240 bp，β-actin 為內(nèi)參。

1.8 Western blot 檢測(cè)丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞RUNX-3蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞接種及分組同上，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，參照細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取細(xì)胞總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品加入1/5 體積的5×上樣緩沖液，沸水煮沸5 min 后離心，以每孔20 μg/孔上樣，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h， 加入1∶1000 稀釋的兔抗人RUNX-3 蛋白，4℃過(guò)夜，β-actin 作為內(nèi)參，TBST 洗膜3 次，加入1∶1000稀釋的辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG，室溫孵育2 h，同樣洗膜3 次，ECL 顯色，觀察各條帶深淺變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析， 兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。 以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞活力的影響

丹皮酚在15.63～250 mg/L 濃度范圍內(nèi)均能有效降低結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞的生存率，在相同處理時(shí)間，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞生存率逐漸降低；同一藥物濃度，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生存率也逐漸降低，即呈顯著的劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)， 與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0. 05）。 見(jiàn)圖1。

圖1 丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞增殖的影響（n = 5）

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，折光率較高，胞體大，形態(tài)成梭形或多邊形，胞質(zhì)均勻透明，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)變化不大。 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖減慢，且隨著丹皮酚濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸變小、變圓，折光率減弱，核濃縮等，部分脫落漂浮于培養(yǎng)瓶中，但細(xì)胞膜完整，最后裂解。 丹皮酚濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，上述表現(xiàn)越明顯，漂浮細(xì)胞越多。

250 mg/L 丹皮酚組可見(jiàn)大量懸浮的細(xì)胞碎片。

2.3 丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，丹皮酚濃度為0 mg/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率為（2.3±0.9）%；丹皮酚濃度分別為31.25、62.50、125 mg/L 作用 細(xì)胞48 h 后， 凋亡率分別為（12.3±1.3）%、（22.4±1.5）%、（36.2±2.1）%， 與對(duì)照組[（2.3±0.9）%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），表明丹皮酚能誘導(dǎo)LoVo 細(xì)胞凋亡。 見(jiàn)圖2。

2.4 丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的影響

圖2 丹皮酚對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

鈣離子熒光劑Fluo-3/AM 能特異性與Ca2+結(jié)合，本研究所測(cè)的熒光強(qiáng)度反映的是細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的相對(duì)水平，并不代表實(shí)際細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。 如圖3 所示， 丹皮酚作用后人結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且隨著濃度的升高而增強(qiáng)。 圖像分析結(jié)果顯示，對(duì)照組（丹皮酚濃度為0 mg/L）細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度為 （24.45±3.74）， 丹皮酚濃度分別為31.25、62.50、125 mg/L 時(shí)作用LoVo 細(xì)胞48 h 后，熒光強(qiáng)度分別為（41.36±4.62），（57.51±3.83）和（69.43±3.76）；丹皮酚組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 見(jiàn)圖3。

2.5 丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞RUNX-3 mRNA 表達(dá)的影響

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RUNX-3 基因的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶為179 bp， 內(nèi)參β-actin 條帶為240 bp，與所設(shè)計(jì)的片段大小一致， 丹皮酚處理人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞48 h 后，RUNX-3 基因的表達(dá)均上調(diào)，且隨藥物濃度的升高，LoVo 細(xì)胞RUNX-3 基因的表達(dá)量亦升高，呈明顯劑量依賴效應(yīng)。 見(jiàn)圖4。

2.6 丹皮酚對(duì)RUNX-3 蛋白表達(dá)的影響

丹皮酚處理LoVo 細(xì)胞48 h 后，結(jié)果顯示隨著丹皮酚濃度的升高，RUNX-3 蛋白表達(dá)量也逐漸升高。見(jiàn)圖5。

3 討論

細(xì)胞凋亡是維持多細(xì)胞機(jī)體平衡的一個(gè)重要生理機(jī)制，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖之間的平衡在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]，細(xì)胞凋亡是程序化、多基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過(guò)程，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。 有研究證實(shí)，丹皮酚在體內(nèi)外均能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚在15.63～250 mg/L 濃度范圍，對(duì)人結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞的增殖均有抑制作用， 隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制細(xì)胞增殖的作用亦逐步增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。 丹皮酚處理人結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞后， 在倒置顯微鏡下均可見(jiàn)到凋亡細(xì)胞的形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高， 呈明顯的劑量依賴效應(yīng)， 表明丹皮酚可抑制結(jié)腸癌LoVo 細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)丹皮酚對(duì)LoVo [Ca2+]i 的影響

圖4 丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞RUNX3 mRNA 表達(dá)的影響

圖5 Western blot 檢測(cè)丹皮酚對(duì)LoVo 細(xì)胞RUNX3 蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞內(nèi)Ca2+廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動(dòng)及凋亡等病理生理過(guò)程[9]，鈣離子在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的重要作用已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)[10]，研究顯示，在細(xì)胞凋亡早期和晚期階段細(xì)胞內(nèi)Ca2+均增加， 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[11]。 本研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚處理后，LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)，且隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組比較，有顯著差異性（P < 0.05）。LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的增加與細(xì)胞凋亡率呈平行關(guān)系， 且這種效應(yīng)隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。 提示LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增多與藥物作用有關(guān)，表明Ca2+升高在丹皮酚抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制中可能起重要作用，提示調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡可能是其作用機(jī)制之一。 因此，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量可能成為結(jié)腸癌治療的一個(gè)作用靶點(diǎn)。 丹皮酚具體參與Ca2+通道運(yùn)輸系統(tǒng)的調(diào)控及丹皮酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路還需進(jìn)一步研究。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能上調(diào)LoVo 細(xì)胞中人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（human runt-related transcription factor 3，RUNX3）基因表達(dá)，且表達(dá)量隨著藥物濃度的升高而增加，呈明顯濃度效應(yīng)。大量研究證明，轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β （transforming growth factor，TGF-β）和Wnt 信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[12-13]。 RUNX3 參與TGF-β 信號(hào)通路誘導(dǎo)生長(zhǎng)抑制的過(guò)程[14]。 研究證實(shí)，RUNX3 基因在多種腫瘤如乳腺癌、胃癌、大腸癌、肝癌及肺癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[15-16]。有證據(jù)表明，恢復(fù)RUNX3 基因的表達(dá)能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及下調(diào)cyclin D1 的表達(dá)而顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能抑制腫瘤細(xì)胞向G1期行進(jìn)和G1/S 轉(zhuǎn)換 （結(jié)果待發(fā)）。 并且RUNX3 基因表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)與流式細(xì)胞儀檢測(cè)的凋亡率增升高趨勢(shì)是一致的。 因此，推測(cè)丹皮酚能通過(guò)上調(diào)RUNX3 基因表達(dá)影響細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)丹皮酚處理后，LoVo 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量與RUNX3 基因表達(dá)均升高， 即丹皮酚一方面能增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量， 另一方面又能促進(jìn)RUNX3 基因表達(dá)， 表明兩者可能處于同一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上。 研究表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增加參與包括基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞凋亡在內(nèi)的多種生物反應(yīng)過(guò)程[19-20]，提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量與RUNX3 基因相互協(xié)調(diào)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。丹皮酚能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量及上調(diào)RUNX3 基因的表達(dá)。 由此推測(cè)，丹皮酚和阿司匹林可能通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量， 上調(diào)LoVo 細(xì)胞RUNX3 基因的表達(dá)，恢復(fù)了TGF-β 信號(hào)通路生理功能，并抑制了Wnt 信號(hào)通路，抑制LoVo 細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

腫瘤的凋亡是一個(gè)復(fù)雜而又精確調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，Ca2+含量與RUNX3 基因之間相關(guān)信號(hào)通道，是下一步要進(jìn)行的工作。

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