黃秀芳 原向偉

1.廣東省江門(mén)市中心醫(yī)院病理科，廣東江門(mén) 529030；2.廣東省江門(mén)市中心醫(yī)院骨科，廣東江門(mén) 529030

骨肉瘤高發(fā)于青少年人群，居于人類(lèi)骨骼系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率第1 位，其惡性程度高，發(fā)展快，許多患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已存在肺轉(zhuǎn)移，因此療效不佳。 目前主要治療方法包括新輔助化療+外科手術(shù)包括保肢或截肢手術(shù)，但能否手術(shù)及保證手術(shù)效果的重要前提是化療有效。臨床上相當(dāng)患者因?yàn)榛熌退幓蚨靖弊饔么蟮葐?wèn)題，引起化療失敗，導(dǎo)致患者無(wú)法行保肢手術(shù)從而截肢，甚至無(wú)法手術(shù)而導(dǎo)致死亡[1]。 因此，提高化療療效對(duì)于骨肉瘤的治療來(lái)講具有重大意義。IFN-α 屬于Ⅰ型干擾素，具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用[2]，IFN-α 可直接抑制耐藥骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[3]，然而其對(duì)骨肉瘤化療敏感性的影響目前尚不清楚。因此筆者聯(lián)合使用IFN-α 與依托泊苷（Etoposide）處理人骨肉瘤U2OS 和MG63 細(xì)胞，探討其對(duì)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡的影響，并研究其分子機(jī)制，以期為提高骨肉瘤對(duì)化療藥物敏感性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細(xì)胞U2OS（p53 基因野生型）和MG63（p53 基因突變型）購(gòu)自中山大學(xué)病理教研室，培養(yǎng)液為DMEM（GIBCO 產(chǎn)品），其中含10%胎牛血清（GIBCO 產(chǎn)品）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，培養(yǎng)于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱（Forma，美國(guó)）。

1.2 藥物處理

IFN-α 購(gòu)自Peprotech 公司， 批號(hào)300-02A，Etoposide 購(gòu)自Sigma 公司， 批號(hào)E1383， 稀釋分裝凍存-20℃， 使用時(shí)采用DMEM 培養(yǎng)液稀釋成工作濃度，處理分為四組：對(duì)照組（加入與等量于其余組的DMEM 培養(yǎng)液）、IFN-α （加入含工作濃度藥物的DMEM 培養(yǎng)液使終濃度為5000 U/mL） 組，Etoposide（終濃 度 在U2OS 細(xì) 胞 為2.5 μg/mL、MG63 細(xì) 胞 為0.625 μg/mL）組和IFN-α＋Etoposide（終濃度同上）組。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)處理后， 消化離心， 收集細(xì)胞；PBS 洗兩次，離心；70%乙醇固定過(guò)夜；細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L 的碘化丙啶（PI）染色5 min，4℃避光30 min；上FCM 流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）用488 nm 激發(fā)光檢測(cè)細(xì)胞DNA含量，LYSIS 軟件分析凋亡率。

1.4 DNA Ladder 檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)各處理后，消化離心，收集細(xì)胞；PBS 洗兩次；加入0.8 mL 的DNAzol（Invitrogen 產(chǎn)品，批號(hào)：10503-027），室溫放置數(shù)分鐘；4℃離心15 min；將上清移入新EP 管， 加入0.4 mL 的無(wú)水乙醇；4℃離心10 min；棄上清，加入75%乙醇洗2 次，加入適量TE 溶解基因組DNA，在含有EB 的1.8%瓊脂糖凝膠電泳（水平電泳槽為北京六一廠產(chǎn)品），紫外線激發(fā)，凝膠成像分析儀（Bio-Rad，美國(guó)）采集DNA 梯形條帶。

1.5 Western blot

收集細(xì)胞，PBS 清洗離心，加入蛋白裂解液，定量蛋白（BCA 法），SDS-PAGE 電泳（垂直電泳儀為美國(guó)Bio-Rad 產(chǎn)品），然后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜（電轉(zhuǎn)儀為美國(guó)Bio-Rad 產(chǎn)品），將膜封閉于含5%脫脂奶粉的TBST，4℃過(guò)夜； 鼠抗人p53、MDM2、Bax、Bcl-2、GAPDH 單克隆抗體和兔抗人PARP 多克隆抗體均為SantaCruz公司產(chǎn)品，稀釋后室溫封膜3 h 或4℃過(guò)夜，二抗稀釋后室溫封膜1 h 或4℃過(guò)夜， 暗室ECL 化學(xué)發(fā)光，膠片顯影，定影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 14.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用q 檢驗(yàn)。 以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-α 在U2OS 和MG63 細(xì)胞對(duì)Etoposide 引起凋亡的影響

U2OS 和MG63 細(xì)胞經(jīng)IFN-α （5000 U/mL）和etoposide（U2OS 細(xì) 胞 為2.5 μg/mL、MG6 細(xì) 胞 為0.625 μg/mL）單獨(dú)或聯(lián)合處理72 h 后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，U20S 細(xì)胞在對(duì)照組、IFN-α 組、Etoposide 組和IFN-α+Etoposide 的細(xì)胞凋亡率分別為：（5.1±2.3）%、（5.7±2.7）%、（15.3±3.8）%和（45.5±5.2）%（圖1A），結(jié)果表明IFN-α 單獨(dú)并不誘導(dǎo)明顯的U2OS 細(xì)胞凋亡，卻明顯增強(qiáng)了Etoposide 誘導(dǎo)的U2OS 細(xì)胞凋亡，Etoposide 組與IFN-α+Etoposide 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。然而同樣處理MG63 細(xì)胞后結(jié)果顯示，MG63 細(xì)胞在對(duì)照組、IFN-α 組、Etoposide 組和IFN-α+Etoposide 組的細(xì)胞凋亡率分別為：（2.2±0.8）%、（2.5±1.1）%、（23.8±4.6）%和（24.9±5.3）%（圖1B），表明IFN-α 不僅單獨(dú)不誘導(dǎo)明顯的MG63 細(xì)胞凋亡， 也無(wú)增強(qiáng)Etoposide 誘導(dǎo)的MG63 細(xì)胞凋亡的作用，Etoposide 組與IFN-α+Etoposide 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)α 干擾素對(duì)依托泊苷誘導(dǎo)的U2OS 和MG63細(xì)胞凋亡的影響

2.2 IFN-α 在U2OS 和MG63 細(xì)胞中對(duì)“DNA 梯形條帶”的影響

U2OS 和MG63 細(xì)胞經(jīng)IFN-α （5000 U/mL）和etoposide （U2OS 細(xì) 胞 為2.5 μg/mL，MG6 細(xì) 胞 為0.625 μg/mL）單獨(dú)或聯(lián)合處理72 h 后進(jìn)行DNA Ladder 電泳。 DNA Ladder 是凋亡的特征性表現(xiàn)，結(jié)果顯示， 與其他各組相比，IFN-α/Etoposide 組的U20S 細(xì)胞出現(xiàn)明顯的梯形條帶（圖2A）；而在MG63 細(xì)胞，各組均未出現(xiàn)明顯梯形條帶（圖2B）。 表明IFN-α 可明顯增強(qiáng)Etoposide 誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞凋亡， 并且這種效應(yīng)僅出現(xiàn)在p53 功能正常的U2OS 細(xì)胞中，而在因突變導(dǎo)致p53 功能喪失的MG63 細(xì)胞中無(wú)此效應(yīng)，提示了p53 可能參與此效應(yīng)。

圖2 DNA 梯形條帶分析α 干擾素對(duì)依托泊苷誘導(dǎo)的U2OS 和MG63 細(xì)胞凋亡的影響

2.3 IFN-α 在U2OS 細(xì)胞中對(duì)Etoposide 引起PARP活化的影響

U2OS 細(xì)胞經(jīng)IFN-α （5000 U/mL） 和etoposide（2.5 μg/mL）單獨(dú)或聯(lián)合處理72 h 后進(jìn)行western blot檢測(cè)PARP 蛋白活化。 采用Western blot 法檢測(cè)凋亡關(guān)鍵酶PARP 的裂解，結(jié)果表明，在U2OS 細(xì)胞，對(duì)照組、IFN-α 組和Etoposide 組均未出現(xiàn)PARP 的活化，在聯(lián)合用藥組可見(jiàn)116 KD 的無(wú)活性PARP 前體明顯裂解為85 KD 的活化片段（圖3）。提示聯(lián)合用藥明顯增強(qiáng)PARP 活化，從而觸發(fā)U2OS 細(xì)胞凋亡。

圖3 α 干擾素在U2OS 細(xì)胞中增強(qiáng)依托泊苷誘導(dǎo)的PARP 裂解活化（Western blot 法）

2.4 IFN-α 對(duì)Etoposide 活化p53 凋亡通路的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證IFN-α 對(duì)Etoposide 的增敏作用與野生型p53 的功能有關(guān)，筆者進(jìn)一步檢測(cè)了p53 凋亡通路相關(guān)基因p53、Bax、Bcl-2、Mdm2 等的表達(dá)。如圖4所示， 在U2OS 細(xì)胞中，IFN-α 單獨(dú)對(duì)p53 及其靶基因MDM2 的表達(dá)無(wú)明顯影響， 而Etoposide 可明顯增強(qiáng)二者的表達(dá)， 聯(lián)合用藥則進(jìn)一步增高二者的表達(dá)。Bax 和Bcl-2 均是p53 的下游調(diào)控基因， 促凋亡的Bax 的表達(dá)被Etoposide 增高， 并被IFN-α+Etoposide進(jìn)一步增強(qiáng)；與對(duì)照組相比，抗凋亡的Bcl-2 的表達(dá)雖然在Etoposide 組無(wú)變化，卻被聯(lián)合用藥明顯減弱。因此p53、Bax、MDM2 和Bcl-2 的表達(dá)變化與凋亡保持同步， 提示了在IFN-α 通過(guò)激活p53 凋亡通路增強(qiáng)Etoposide 誘導(dǎo)U2OS 細(xì)胞凋亡。 然而在MG63 細(xì)胞中，上述基因的蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化，與MG63細(xì)胞中的陰性結(jié)果相符合。

圖4 IFN-α 在U2OS、MG63 細(xì)胞中對(duì)Etoposide 誘導(dǎo)p53，Bax，Mdm2 和Bcl-2 表達(dá)的影響（Western blot 法）

3 討論

干擾素是一類(lèi)多功能細(xì)胞因子， 具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)作用[1]，包括Ⅰ型和Ⅱ型， 其中IFN-α 屬于Ⅰ型干擾素， 可與細(xì)胞表面的IFN-α/β 受體結(jié)合， 從而引起JAK1 和TYK 的活化，活化的JAK1 和TYK 可分別使STAT1 發(fā)生和酪氨酸位點(diǎn)（Tyr701）和絲氨酸位點(diǎn)（Ser727）的磷酸化，磷酸化的STAT1 蛋白形成同源或異源二聚體， 進(jìn)入細(xì)胞核與其靶基因啟動(dòng)子上的干擾素刺激反應(yīng)元件或者γ 活化序列結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控下游基因表達(dá)[4]。 IFN-α 也是臨床治療腫瘤的第一種細(xì)胞因子， 已用于膀胱癌、腎癌、肝癌、白血病的臨床治療[5]。

以依托泊苷、阿霉素、順鉑等DNA 損傷性藥物為代表的傳統(tǒng)化療藥物已廣泛用于人類(lèi)骨肉瘤的新輔助化療，并獲得一定療效，但因其無(wú)腫瘤靶向特異性，常常在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也破壞正常組織細(xì)胞，從而帶來(lái)嚴(yán)重的毒副作用，最終導(dǎo)致化療的失敗并影響骨肉瘤的最終療效[6-7]。 有研究表明IFN-α 本身即可抑制多藥耐藥的骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3]，那么IFN-α 聯(lián)合化療藥物對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)是否存在協(xié)同作用，筆者對(duì)此進(jìn)行了一系列研究。

CAD（caspase activated DNAase）是細(xì)胞中一種能切割染色質(zhì)的核酸酶， 可被caspase-3 激活，CAD 可識(shí)別DNA 序列中的特定位點(diǎn)，將細(xì)胞基因組DNA在核小體單位之間的連接處剪斷，從而形成180～200 bp或其整數(shù)倍大小的寡核苷酸片段， 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳會(huì)出現(xiàn)梯形電泳條帶，是凋亡的特征性表現(xiàn)，因而成為鑒定凋亡的經(jīng)典指標(biāo)[8]。 筆者從流式細(xì)胞術(shù)和形態(tài)學(xué)兩方面證明IFN-α 對(duì)U2OS 細(xì)胞無(wú)明顯影響，卻明顯增強(qiáng)Etoposide 誘導(dǎo)凋亡， 提示二者聯(lián)用比化療藥物單用具有更好的抗癌作用。 并且，在U2OS 細(xì)胞中，聯(lián)合用藥可明顯增強(qiáng)PARP[poly（ADP-ribose）polymerase]的活化。實(shí)際上，PARP 是反映凋亡的經(jīng)典指標(biāo)，受到促凋亡信號(hào)的刺激后，細(xì)胞內(nèi)蛋白酶Caspases 家族成員caspase 8、9 被激活， 繼而激活下游效應(yīng)性caspase 3，最終裂解其底物PARP 發(fā)生活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。 上述變化在p53 基因突變而喪失功能的MG63 細(xì)胞中卻沒(méi)有發(fā)生，這提示此效應(yīng)可能與p53 有關(guān)。 p53 是一個(gè)經(jīng)典的抑癌基因，在超過(guò)50%的惡性腫瘤包括骨肉瘤中都存在缺失或突變， 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[10]， 作為凋亡調(diào)控的主要靶點(diǎn)， 激活的p53 可通過(guò)調(diào)節(jié)其下游基因如MDM2，Bax、Bcl-2 等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡[10]。 目前，p53 已被認(rèn)為是眾多化療藥物（包括Etoposide）抗癌作用的主要介導(dǎo)者[7]。 不僅如此，最近研究表明，p53 也參與了IFN-α 引發(fā)的信號(hào)通路[11]。 筆者發(fā)現(xiàn)，Etoposide 激活了p53 及其下游基因如MDM2、Bax 等的表達(dá)。 IFN-α 雖然單獨(dú)應(yīng)用對(duì)p53 通路無(wú)明顯影響， 卻明顯增強(qiáng)Etoposide 引起的p53、Bax 和MDM2的表達(dá)，同時(shí)減弱了Bcl-2 的表達(dá)，充分說(shuō)明IFN-α通過(guò)激活p53 依賴(lài)性信號(hào)通路增強(qiáng)Etoposide 誘導(dǎo)的U2OS 細(xì)胞凋亡。

MDM2 基因是調(diào)節(jié)p53 的一個(gè)重要因子， 它在細(xì)胞核中直接與p53 結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，并通過(guò)胞核-胞漿穿梭將p53 轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿并使其降解，從而降低p53 水平；另一方面，p53 的上調(diào)可激活MDM2轉(zhuǎn)錄表達(dá)，來(lái)反饋性抑制p53 蛋白的繼續(xù)增高。如此二者形成一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)， 使細(xì)胞內(nèi)MDM2/p53比率保持恒定[12]。 本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥引起的p53上調(diào)伴隨著MDM2 水平的升高，表明p53 的上調(diào)反饋性地激活了MDM2 的表達(dá)，使其水平升高。Bax 和Bcl-2 基因同屬Bcl-2 家族， 均為p53 的靶基因，表達(dá)于線粒體，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因[13]。二者功能相互拮抗，Bax 具有促進(jìn)凋亡的作用，Bcl-2 則具有抗凋亡的作用， 二者的比例決定了細(xì)胞是否走向凋亡[14-16]。 而聯(lián)合用藥通過(guò)激活p53 上調(diào)Bax 和下調(diào)Bcl-2，使Bax/Bcl-2 比例增高，從而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。

因此，IFN-α 可通過(guò)誘導(dǎo)p53 依賴(lài)性凋亡來(lái)增強(qiáng)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性，提示IFN-α與骨肉瘤傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可望成為提高骨肉瘤化療療效的新方向。

[1] De Saint SN，F(xiàn)letcher CD.Soft-tissue sarcomas：a update[J].Eur J Surg Oncol，1999，25（2）：215-220.

[2] Prejean C，Colamonici OR.Role of the cytoplasmic domains of the type I interferon receptor subunits in signaling [J].Semin Cancer Biol，2000，10（2）：83-92.

[3] Manara MC，Serra M，Benini S，et al. Effectiveness of Type I interferons in the treatment of multidrug resistant osteosarcoma cells [J]. Int J Oncol，2004，24（2）：365-372.

[4] Stark GR，Kerr IM，Williams BR，et al. How cells respond to interferons[J].Annu Rev Biochem，1998，67（3）：227-264.

[5] 郭子文，許曉軍.干擾素輔助小劑量HA 方案治療慢性粒細(xì)胞白血病29 例療效觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（3）：37-38.

[6] Bruland OS，Pihl A.On the current management of osteosarcoma. A critical evaluation and a proposal for a modified treatment strategy [J]. Eur J Cancer，1997，33（11）：1725-1731.

[7] Hande KR. Etoposide：four decades of development of a topoisomerase II inhibitor [J]. Eur J Cancer，1998，34（10）：1514-1521.

[8] Gavrieli Y，Sherman Y，Ben S.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation [J]. J Cell Biol，1992，119（3）：493-501.

[9] Smulson ME，Simbulan-Rosenthal CM，Boulares AH，et al.Roles of poly（ADP-ribosyl）ation and PARP in apoptosis，DNA repair， genomic stability and functions of p53 and E2F-1 [J]. Adv Enzyme Regul，2000，40（2）：183-215.

[10] 何均輝，鄒秀玲，李忠楚，等.p53 蛋白在胃癌中的表達(dá)分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（5）：86-88.

[11] Porta C，Hadj SR，Nejmeddine M，et al.Interferons alphaand gamma induce p53-dependent and p53-independent apoptosis， respectively [J]. Oncogene，2005，24（4）：605-615.

[12] Moll UM，Petrenko O. The MDM2-p53 interaction[J]. Mol Cancer Res，2003，1（14）：1001-1008.

[13] Bond J，Haughton M，Blaydes J，et al. Evidence that transcriptional activation by p53 plays a direct role in the induction of cellular senescence[J].Oncogene，1996，13（10）：2097-2104.

[14] Cory S，Adams JM.The Bcl2 family： regulators of the cellular life-or-death switch[J].Nat Rev Cancer，2002，2（9）：647-656.

[15] 黃鳳，毛麗松，張佳.Bcl-2、IGF-2 蛋白在子宮肌瘤組織中的表達(dá)及其相關(guān)性研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（13）：13-14.

[16] 王婷，馬云.Bcl-2 在三陰性乳腺癌中的預(yù)后價(jià)值[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2012，50（29）：44-46.