劉倩倩，周 圍,,,*，王 波，王麗婷，楊盛鑫

超高效合相色譜法直接檢測VC方法

劉倩倩1，周 圍1,2,3,*，王 波2，王麗婷3，楊盛鑫3

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000；3.西北師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

建立超高效合相色譜法分離和測定VC的方法。超高效合相色譜技術(shù)集合超臨界流體色譜和超高效液相色譜的技術(shù)優(yōu)點，流動相以CO2為主體，甲醇（含0.05% H3PO4）為助溶劑。選用Waters CSH Fluoro-Phenyl（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，流速0.6 mL/min，檢測波長為245 nm，方法檢出限為1.5 mg/kg，線性范圍為5～200 mg/L；加標(biāo)回收率范圍為96.05%～101.15%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%～0.76%，具有高效、檢測速度快、操作簡單、靈敏度高、檢出限低、重復(fù)性好、實驗成本低等優(yōu)點。

超高效合相色譜；VC；測定；食品

VC又叫L-抗壞血酸，屬于水溶性維生素，具有較強的還原作用，參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，是維持人體正常生理代謝不可缺少的一類有機化合物[1]。醫(yī)學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)它不但具有生理活性，而且在人體內(nèi)能夠阻止亞硝胺的形成，具有一定的防癌作用，增加機體對傳染病的抵抗力，對肝炎、肝硬變有療效[2-6]。同時又是一種理想的食品抗氧化劑。但是人體本身不能合成，必須依靠膳食供給，VC廣泛存在于新鮮的水果、蔬菜中[7-9]。因此建立準(zhǔn)確測定VC含量的方法有著非常重要的現(xiàn)實意義。

VC測定的方法一般有碘量法[10]、比色法[11]、電位法[12]、紫外分光光度法[13]、熒光法[14]等，這些方法選擇性較差，容易受其他還原性成分、丙酮酸 和糖等成分的干擾，所需試劑較多、操作繁瑣[15]。近年來高效液相色譜法發(fā)展迅速，它具有高效、快速等特點，但是在實驗過程中有機溶劑耗費多，實驗成本較高，并對環(huán)境或多或少造成一定的污染。眾多文獻均在傳統(tǒng)的反相液相色譜中對VC進行分離分析，由于VC本身具有較高極性而導(dǎo)致保留時間較短，嚴(yán)重影響到VC的準(zhǔn)確定量。采用超高效合相色譜法對VC進行直接檢測的方法卻鮮有報道，超高效合相色譜除了具有傳統(tǒng)超高效液相色譜所具有的優(yōu)點外，還與超臨界流體色譜技術(shù)進行結(jié)合，以超臨界流體CO2為流動相主體，依靠流動相的溶劑化能力來進行分離、分析的色譜過程[16-17]。加之亞2 μm填料技術(shù)，能夠通過精確地調(diào)節(jié)流動相強度、壓力和溫度，獲得所需的系統(tǒng)分辨率和選擇性，對待測物的保留和分離進行有效調(diào)控，具有操作溫度低，有機溶劑使用量少、靈敏度高、重復(fù)性好、分析速度快等優(yōu)點[18-21]。超臨界流體是指物質(zhì)高于其臨界溫度和臨界壓力時的一種物態(tài)，它既不是氣體，也不是液體，但它兼有氣體的低黏度、液體的高密度、以及介于氣液體之間的擴散系數(shù)的特征[22]。VC在紫外波長245 nm處有特異性吸收峰，樣品經(jīng)均質(zhì)、稀釋、過膜后，直接檢測食品中的VC，可通過保留時間定性，峰面積定量。本實驗通過系統(tǒng)考察超高效合相色譜對VC分離的影響因素，為準(zhǔn)確檢測VC建立一種可靠、快速、節(jié)約型的分離分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮橘子、鮮棗、干棗、飲料（水溶C100） 市購。

VC（純度99%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司 ；CO2（純度99.997%） 蘭州匯能公司；甲醇、乙腈、異丙醇（色譜純） 德國Merck KGaA公司；H3PO4（色譜純） 天津科密歐公司；蒸餾水 廣州屈臣氏。

1.2 儀器與試劑

超高效合相色譜儀（配有Waters EmpowerTM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Waters公司；冷凍離心機 美國Sigma公司；均質(zhì)機 德國IKA公司；移液槍 美國Thermo Electron公司；50 mL聚乙烯管、容量瓶。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精確稱取0.020 g VC，用含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液，準(zhǔn)確定容至100 mL容量瓶中，配制成200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃冷藏待用（4 h后重新配制）。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移1 000、750、500、250、100、50、25 μL標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別稀釋為200、150、100、50、20、10、5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃冷藏待用（4 h后重新配制）。

1.3.2 超高效合相色譜條件

色譜柱：Waters CSH Fluoro-Phenyl（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A為CO2，B為甲醇（含0.05% H3PO4溶液）；流速0.6 mL/min；進樣量1 μL；柱溫30 ℃；檢測波長245 nm；動態(tài)背壓2 000 psi；梯度洗脫：0～0.2 min時8%甲醇，3 min時甲醇8%～35%，4.3 min時甲醇35%～8%。

1.3.3 樣品處理

固體及半固體樣品：分別準(zhǔn)確稱取樣品5.00 g于50 mL聚乙烯管中，加入15 g含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液后，均質(zhì)5 min，高速冷凍離心機于4 ℃條件下以13 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL（VC含量較高時可適當(dāng)進行稀釋），經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，直接進樣分離分析。

液體樣品：準(zhǔn)確稱取2.00 g飲料于50 mL聚乙烯管中，加入含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液至20 g，置于高速冷凍離心機于4 ℃以13 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，直接進樣分離分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流速的選擇

超臨界CO2作為流動相時，由于具有的低黏度和高的擴散系數(shù)，使它在分離過程中具有較高的線速度，分析速度比傳統(tǒng)高效液相色譜快3～10 倍，分析時間更短，同樣，在此情況下，超臨界流體色譜可以使用更長的色譜柱，得到更大的柱效及分離效率。

本實驗通過使用超高效合相色譜，對亞2 μm填料的色譜柱進行流速優(yōu)化，流速在0.4～1.0 mL/min范圍內(nèi)進行優(yōu)化，為了保證較好的靈敏度、色譜柱壓力以及盡可能與雜質(zhì)的分離，本實驗選擇0.6mL/min為最佳流速。VC標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

圖1 VC標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Chromatogram of vitamin C

2.2 助溶劑選擇

由于超高效合相色譜流動相主要是以CO2為主體的超臨界流體，為了調(diào)整流動相的極性以及對目標(biāo)物的溶解性，可加入甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、乙酸乙酯等助溶劑，以適應(yīng)對不同目標(biāo)化合物的不同溶解性，有效改變目標(biāo)化合物的峰形及保留時間。本實驗通過使用甲醇、異丙醇、乙腈3 種常用的、不同極性的助溶劑對VC進行分離，分別見圖2。

圖2 不同助溶劑分離的VC標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of vitamin C separated with different co-solvents

由圖2可以看出，隨著助溶劑極性的降低，流動相的溶解能力也相應(yīng)得到改變，使得VC的出峰時間很大程度的推遲，甚至在使用乙腈為助溶劑時，VC因為保留太強而沒有出峰，因此，可以推斷出助溶劑的選擇對于目標(biāo)化合物的峰形及保留時間起著至關(guān)重要的作用。

2.3 改性劑的選擇

由于VC為弱酸性、水溶性維生素，在酸性條件下可以適當(dāng)改善維生素的峰形，故在流動相中加入少量的磷酸作為改性劑，實驗選擇0.05% H3PO4、0.1% H3PO4、0.15% H3PO4作為改性劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種不同水平梯度的磷酸-甲醇溶液均對VC的拖尾峰形有較好的改善，VC標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和未添加改性劑的色譜圖見圖1、圖2A。鑒于流動相酸性較高，長時間使用時會損傷色譜柱、降低柱效，故將0.05% H3PO4作為流動相的改性劑。

2.4 動態(tài)背壓的選擇

超高效合相色譜中，動態(tài)背壓是影響分離過程的重要因素之一。它主要作用是控制CO2在整個操作過程中維持超臨界狀態(tài)，當(dāng)背壓升高時，超臨界流體密度會增大，溶劑化能力增強，柱壓升高。本實驗以CO2和甲醇（含0.05% H3PO4）為流動相，考察背壓在1 800～2 200 psi范圍內(nèi)對樣品分離的影響。結(jié)果表明，背壓越大，密度、黏度隨之增加，柱壓也會升高，使得目標(biāo)物色譜峰的保留時間減少。通過對樣品基質(zhì)、保留時間及色譜柱壓力的綜合考慮，當(dāng)背壓為2 000 psi時，VC與雜質(zhì)分離最好，時間最短、峰形對稱，故選擇背壓為2 000 psi。

2.5 色譜柱溫度選擇

為了對樣品中VC得到更好的分離效果，保持其他色譜條件不變，本實驗還考察柱溫在25～55 ℃范圍內(nèi)對分離的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，VC的保留時間逐漸延長，這與傳統(tǒng)超高效液相色譜是不相同的。這是因為色譜柱溫度越高，超臨界流體密度越小，溶劑化能力降低，超臨界流體可能對VC溶解及交換能力減弱，使得VC的保留時間增大。另外，考慮到色譜柱溫度較高時，會加速VC的氧化分解，故本實驗選擇溫度30 ℃為最佳分離溫度。

2.6 方法考察

2.6.1 線性范圍和靈敏度

在優(yōu)化實驗條件下，選取200、150、100、50、20、10、5mg/L的VC系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.2節(jié)色譜條件進行測定，繪制樣品水平（橫坐標(biāo)x，mg/L）與峰面積（縱坐標(biāo)y，μU/s）標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸。結(jié)果表明，該方法在5～200 mg/L范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，線性方程為Y=3.13×103X-2.66×103，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9。該方法對VC的檢出限為1.5 mg/kg，定量限為5 mg/kg。

2.6.2 回收率和精密度

分別準(zhǔn)確稱取5.00 g橘子和2.00 g飲料樣品，加入3 個水平的添加量（5、50 mg/kg和200 mg/kg）的VC，置于50 mL聚乙烯管中，加入15 g含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液后，均質(zhì)5 min，高速冷凍離心機于4 ℃條件下以13 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，按1.3.2節(jié)色譜條件進樣測定，計算其回收率。結(jié)果表明，該方法的加標(biāo)回收率在96.05%～101.15%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%～0.76%。方法的回收率和重復(fù)性均較好。

2.7 實際樣品測定

利用上述實驗優(yōu)化條件，分別稱取橘子、飲料、鮮棗、干棗各5.00 g，置于50 mL聚乙烯管中，加入15 g含0.05% H3PO4的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液后，經(jīng)均質(zhì)、離心后，取上清液1 mL過膜，按1.3.2節(jié)色譜條件進樣測定，見圖3，結(jié)果表明，橘子、飲料、鮮棗、干棗中VC含量分別為184.35、324.78、2 163.62、20.12 mg/kg。該測試方法可以對含VC的食品，無需進行復(fù)雜前處理，直接進樣、直接檢測。本方法完全能夠滿足VC的檢測。

圖3 樣品測定色譜圖Fig.3 Chromatograms of samples

3 結(jié) 論

利用超高效合相色譜對VC進行檢測，整個前處理過程簡單、分析時間短、結(jié)果可靠，有效避免VC在長時間、復(fù)雜、繁瑣的前處理及檢測過程中的損失，很大程度的提高了食品中VC檢測的準(zhǔn)確性。由于流動相為CO2超臨界流體，對環(huán)境幾乎不造成污染，運行成本低。本實驗通過超高效合相色譜法對VC檢測的研究可以看出，超高效合相色譜將對未來的色譜分析提供新的方向。

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Direct Determination of Vitamin C by Ultra Performance Convergence Chromatography

LIU Qian-qian1, ZHOU Wei1,2,3,*, WANG Bo2, WANG Li-ting3, YANG Sheng-xin3
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730000, China; 3. College of Geography and Environment Science, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China)

A new method was developed for the determination of vitamin C in foods by ultra performance convergence chromatography (UPC2). The mobile phase was a mixture of supercritical CO2and methanol (containing 0.05% H3PO4) at a flow rate of 0.6 mL/min. A Waters CSH Fluoro-Phenyl column (3.0 mm × 100 mm, 1.7 μm) was used, and the UV detector was set at 245 nm. The limit of detection (LOD) was 1.5 mg/kg, and the calibration linear range was between 5 and 200 mg/L. The spiked recoveries of vitamin C were 96.05%-101.15%, with relative standard deviation (RSD) ranging from 0.52% to 0.76%. The method is efficient, rapid, simple, sensitive, accurate, repeatable and low-cost with a low limit of detection. It can be applied for the determination of vitamin C in foods.

ultra performance convergence chromatography (UPC2); vitamin C; determination; food

TS201.6

A

1002-6630（2014）16-0208-04

10.7506/spkx1002-6630-201416040

2013-10-31

劉倩倩（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：119252610@qq.com

*通信作者：周圍（1957—），男，研究員，博士，研究方向為食品營養(yǎng)及食品安全分析。E-mail：zhouwei845@163.com