晏慧莉，張富新,*，李延華，賈潤芳，李龍柱，艾 對，楊吉妮

非衍生化-氣相色譜法測定羊奶中短中鏈游離脂肪酸

晏慧莉1，張富新1,*，李延華2，賈潤芳1，李龍柱1，艾 對1，楊吉妮1

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062；2.富平縣畜牧技術(shù)推廣中心 ，陜西 富平 711700）

建立羊奶中短中鏈游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）的非衍生化-氣相色譜分析方法。其測定過程包括羊奶中脂肪的提取、FFA的分離和氣相色譜測定3 個部分。首先用乙醇-乙醚-正庚烷將羊奶中脂質(zhì)進行提取，然后采用氨丙基固相萃取柱將FFA進行分離，最后用氣相色譜法測定FFA含量。采用外標法測定羊奶中FFA的回收率，以此作為FFA的校對系數(shù)。結(jié)果表明，羊奶中長鏈FFA的回收率較高，而短鏈FFA的回收率較低，尤其是C2︰0和C4︰0回收 率僅為23.9%和78.5%，但其回收率相對穩(wěn)定，相對標準偏差小于0.04%，可校對測定過程中FFA的損失。

羊奶；氣相色譜；固相萃取；游離脂肪酸

羊奶營養(yǎng)價值很高，易被人體消化吸收，其營養(yǎng)價值組成接近母奶，是嬰幼兒及老年人理想的營養(yǎng)佳品。但羊奶具有膻味，影響產(chǎn)品的消費。目前人們認為，羊奶的膻味主要由奶中的短中鏈脂肪酸引起的，尤其是奶中的游離脂肪酸[1-5]。大量研究表明，羊奶中的短中鏈脂肪酸含量較高，其含量約高出牛奶一倍，其中辛酸和癸酸含量是牛奶的3～5 倍[6]。羊奶中的脂肪酸由兩部分組成，一部分是與甘油結(jié)合的脂肪酸，另一部分是游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA），而FFA含量及種類與羊奶的膻味密切相關(guān)[7-9]。目前測定奶中脂肪酸的方法較多，主要有氣相色譜法[10]、高效液相色譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[5]和紅外光譜分析法[12]等，其中氣相色譜法應(yīng) 用最為廣泛。用氣相色譜法測定奶中脂肪酸時，通常采用衍生化方法，先將脂肪提出，再用三氟化硼等試劑對脂肪酸甲酯化[11-14]，然后用氣相色譜儀分析。衍生化方法對測量奶中總脂肪酸十分有效，但在測定奶中FFA時，由于其含量較低，且一些短中鏈脂肪酸具有揮發(fā)性或半揮發(fā)性，在衍生化時易揮發(fā)損失從而影響測定結(jié)果[15-16]。de Jong[17]應(yīng)用有機溶劑將奶中的脂類物質(zhì)提取后，再將中性脂肪與游離脂肪酸分離，不經(jīng)過衍生化，直接應(yīng)用氣相色譜法進行測定，從而減少FFA在測定過程中的損失，但應(yīng)用有機溶劑提取法將中性脂肪與FFA分離時也會存在一些FFA的損失，尤其是短鏈脂肪酸。本研究在 de Jong[17]方法的基礎(chǔ)上，應(yīng)用外標法在羊奶中加入C2∶0～C16∶0的FFA標準品，應(yīng)用非衍生化-氣相色譜法，對羊奶中FFA的回收率進行測定，以確定FFA的校對系數(shù)，實現(xiàn)FFA的精確定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薩能羊混合奶樣（在-40 ℃冰箱中冷凍保存，測定前在25 ℃水浴鍋中解凍） 陜西富平縣某奶品企業(yè)。

FFA標品：C2∶0（乙酸）、C4∶0（丁酸）、C6∶0（己酸）、C8∶0（辛酸）、C10∶0（癸酸）、C12∶0（月桂酸）、C14∶0（肉豆蔻酸）和C16∶0（棕櫚酸）（純度＞99%）美國Nu-Chekprep公司；甲酸、無水乙醇、正庚烷、異丙醇（均為色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醚、氯仿、無水硫酸鈉（均為分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace2000氣相色譜儀（檢測器為氫火焰離子檢測器FID） 美國熱電公司；HP-INNOWAX石英毛細管色譜柱、氨丙基固相萃取柱：500mg、6mL，SampliQ Amino（NH2） 美國Agilent公司；渦旋混合器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；微孔過濾器（0.45 μm） 西安森博試劑公司。

1.3 方法

羊奶中的FFA的測定由脂肪的提取，F(xiàn)FA的分離和氣相色譜儀測定3 個部分組成。

1.3.1 脂肪的提取

采用de Jong[17]的方法，并進行了改進。精確吸取10 mL奶樣，移入50 mL離心管，依次加入10 mL無水乙醇、1 mL硫酸（2.5 mol/L）、15 mL乙醚-正庚烷混合溶液（1∶1，V/V），振蕩20 min后，2 500 r/min離心15 min，然后將含有脂肪的上層液移入150 mL的錐形瓶中（含有1 g無水硫酸鈉）。再用10 mL乙醚-正庚烷（1∶1，V/V）溶液對離心管的下層溶液重復(fù)提取2 次，將提取的含脂肪的上層液全部收集于錐形瓶中。

1.3.2 FFA的分離

采用Kaluzny等[18]的方法將提取脂肪中的FFA與中性脂肪分離。首先向氨丙基固相萃取柱中加入10 mL正庚烷，使其活化。將1.3.1節(jié)提取的脂肪緩慢加入柱中，使其中的FFA吸附在柱內(nèi)；然后向柱中加入10 mL氯仿-異丙醇溶液（2∶1，V/V）洗脫中性脂肪，棄去濾液；再將吸附FFA的氨丙基固相萃取柱用真空泵抽濾1 min，直到氨丙基固相萃取柱中不再有液滴流出；最后用5 mL乙醚溶液（含體積分數(shù)2%的甲酸）對氨丙基固相萃取柱內(nèi)的FFA進行洗脫，用5 mL的容量瓶收集濾液，定容至5 mL。

1.3.3 氣相色譜測定

色譜條件：石英毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，0.25μm），進樣口溫度240 ℃；檢測器溫度260 ℃；載氣N2；流速40 mL/min；H2流速30 mL/min；空氣流速300 mL/min；分流比30∶1；升溫程序：初始溫度130 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持22 min；恒壓分流模式進樣。

進樣前，樣品用一次性針筒式微孔過濾器（0.45 μm）過濾，進樣量1 μL。

1.3.4 標準曲線的建立

用含有體積分數(shù)2%甲酸的乙醚溶液將標準品C2∶0（乙酸）、C4∶0（丁酸）、C6∶0（己酸）、C8∶0（辛酸）、C10∶0（癸酸）、C12∶0（月桂酸）、C14∶0（肉豆蔻酸）和C16∶0（棕櫚酸）配制成不同質(zhì)量濃度的標準溶液。按照1.3.3節(jié)檢測方法，得到8 種標準溶液的氣相色譜圖，根據(jù)出峰時間確定FFA的分離效果。在此基礎(chǔ)上，配制FFA標準品混合溶液（C2∶0（乙酸）、C4∶0（丁酸）、C6∶0（己酸）、C8∶0（辛酸）、C10∶0（癸酸）、C12∶0（月桂酸）、C14∶0（肉豆蔻酸）和C16∶0（棕櫚酸）在混合溶液中質(zhì)量濃度分別為2.10、0.96、0.93、0.91、0.26、2.55、2.48、3.18 mg/mL）。根據(jù)測得的峰面積Y與其對應(yīng)的質(zhì)量濃度X（mg/mL）進行線性回歸，對不同F(xiàn)FA進行定量測定。

1.3.5 加標回收率的測定

為了確定樣品在脂肪的提取和FFA的分離過程中FFA的損失，采用外標法對加標樣品進行回收率測定，分別測定樣品加標前與加標后FFA含量，用公式（1）計算回收率。

1.3.6 樣品中FFA的計算

樣品中實際FFA的含量按公式（2）計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FFA的定量檢測

將FFA標準品的混合溶液用含有體積分數(shù)2%甲酸的乙醚溶液配制成5 個不同梯度的溶液，按照1.3.3節(jié)條件進行氣相色譜分析，結(jié)果見表1和圖1。由圖1可以看出，在給定儀器的條件下，8 種FFA

圖1 8 種FFA標準品色譜圖Fig.1 GC Chromatograph of FFA standards

表1 8 種FFA標準品的線性方程、保留時間、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 1 Linear regression equations, retention time, correlation coefficients and LODs of 8 FFA standards

標準品能在43 min內(nèi)很好的分離，峰形尖銳，對稱性好，出峰時間穩(wěn)定，且無雜質(zhì)峰干擾，是較為理想的氣相色譜檢測條件。由表2可以看出，8 種FFA標準品的質(zhì)量濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.991～0.998之間，以基線噪音的3 倍峰高（RSN=3）作為檢出限，其值在1.748～4.139 μg/mL之間。由此可見，根據(jù)FFA標準品的出峰時間和峰面積即可對樣品中脂肪酸進行定性定量的分析，具有較高的精確性和高效性。

2.2 FFA加標回收率

圖2 羊奶樣品的FFA色譜圖（加FFA標準品前）Fig.2 GC chromatograph of goat milk sample without the addition of FFA standards

向羊奶樣品中分別加入3 個水平的混合FFA標準品（100、250 μL和500 μL），每個水平測定9 次，然后按照脂肪酸提取、FFA的分離方法處理后，用氣相色譜儀進行分析，結(jié)果見圖2、3和表2。

圖3 羊奶樣品的FFA色譜圖（加入10000 μL FFA標準品）Fig.3 GC chromatograph of goat milk sample spiked with 100 μL of FFA standards

表2 方法的準確度與精密度評價（n=9）Table 2 Accuracy and precision (RSD) of the proposed GC method (n=9)

由表2可以看出，在測定羊奶樣品中FFA時，長鏈脂肪酸回收率較高，而短鏈脂肪酸的回收率較低，尤其是乙酸（C2∶0）和丁酸（C4∶0）的回收率僅為23.9%和78.5%。但從FFA的回收率來看，無論是添加高、中、低3 個水平FFA標準品溶液，其回收率均相對穩(wěn)定，相對標準誤差小于0.04%。因此在實際測定時可用回收率作為校對系數(shù)對FFA進行校對，以補償脂肪提取和FFA在分離過程中損失，來定量測定奶中的實際FFA的含量。

2.3 羊奶中FFA含量的測定

為了驗證非衍生化-氣相色譜法測定羊奶中FFA的穩(wěn)定性，取不同來源的羊奶樣品6 份，應(yīng)用上述方法對其FFA含量進行測定，結(jié)果見表3。

表3 羊奶中FFA含量的測定結(jié)果Table 3 Determination of FFA in goat milk

由表3可以看出，應(yīng)用建立的FFA測定方法，可以對羊奶樣品中C2∶0～C16∶0中短鏈FFA進行測定，應(yīng)用回收率對單個FFA進行校對，其測定結(jié)果RSD值均在5%以內(nèi)，表明應(yīng)用該方法穩(wěn)定性較高，可在實際中應(yīng)用。

3 討論與結(jié)論

目前國內(nèi)外測定奶中脂肪酸大多采用衍生化方法，脂肪酸衍生化后，其沸點降低，更易在氣相色譜儀中被氣化和檢測。但這種方法對高含量的脂肪酸較為適用，對低含量的脂肪酸則損失較為嚴重。同時，這些檢測方法大多是檢測奶中總脂肪酸（包括與甘油三酯結(jié)合的脂肪酸和 FFA），對奶中FFA的檢測報道較少。由于羊奶中的FFA含量較低，衍生化方法其誤差較大，通常采用非衍生化方法測定，其測定過程主要包括脂質(zhì)的提取和FFA的分離2 個重要步驟。

提取奶中的脂質(zhì)時，常用的試劑是能夠與脂質(zhì)物質(zhì)相溶的乙醚、乙醇等有機溶劑。而奶中FFA在脂質(zhì)相與乳清相之間存在一個平衡，尤其是短鏈脂肪酸，有一定的水溶性，在有機溶劑提取時，其有一定的損失。通常認為FFA的碳鏈越短，其在提取過程中損失越大，de Jong[17]用乙醇-乙醚-正庚烷混合提取時，可較大程度地提取奶中的FFA，因此本實驗采用此方法提取羊奶中的FFA。

在對提取的脂質(zhì)中FFA進行分離時，常用的方法有強陰離子交換法[19]和堿性氧化鋁萃取法[17]。這些方法利用FFA具有一定的極性，可與柱中的物質(zhì)進行吸附，從而使中性脂肪與FFA進行分離。de Jong[17]應(yīng)用強陰離子交換法和堿性氧化鋁分離奶中FFA時發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用強陰離子交換法分離FFA效果較好，可有效降低FFA分離過程中FFA的損失。本實驗采用氨丙基固相萃取小柱具有較強的離子交換作用，屬于陰離子交換柱，用該柱分離羊奶中的FFA，雖然不能完全分離，但可最大限度降低FFA分離過程中的損失。

總之，應(yīng)用非衍生化測定奶中FFA時，短中鏈FFA的損失是測定過程中普遍存在的問題，譚力等[20]利用非衍生化-氣相色譜法測定人血清游離脂肪酸時，C2∶0的回收率僅為18.84%，C4∶0的回收率為81.08%。Chen等[21]在測定奶中FFA時，C4∶0的回收率為1.86%，C6∶0的回收率為6.75%，C8∶0的回收率為10.6%。本實驗對羊奶中FFA進行加標回收率測定，同樣出現(xiàn)短中鏈脂肪酸存在回收率較低的現(xiàn)象。原因可能是在有機溶劑的提取中還是存在一定程度損失。此外，實驗最后對FFA洗脫時采用抽真空減壓的方法，可能對氨丙基固相萃取柱上富集的短鏈易揮發(fā)游離脂肪酸產(chǎn)生了影響，關(guān)于這一操作還有待改進，以提高短鏈游離脂肪酸的回收率。但按照該系統(tǒng)的測定程序，其回收率相對穩(wěn)定，可用其校對測定過程中FFA的損失，以獲得較為客觀的測定效果。

本實驗建立了一種非衍生化-氣相色譜法測定羊奶中短中鏈FFA的方法。應(yīng)用FFA的回收率校對測定過程中FFA的損失，解決了傳統(tǒng)測定方法中短鏈脂肪酸易于損失的問題。經(jīng)方法學(xué)驗證，F(xiàn)FA線性關(guān)系良好、檢出限低、加標回收率穩(wěn)定，是一種測定羊奶中短中鏈FFA的有效方法，具有操作簡便、快速和準確的優(yōu)點，可以在測定羊奶及羊奶制品游離脂肪酸中應(yīng)用。

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Determination of Free Fatty Acids in Goat Milk by Gas Chromatography without Derivatization

YAN Hui-li1, ZHANG Fu-xin1,*, LI Yan-hua2, JIA Run-fang1, LI Long-zhu1, AI Dui1, YANG Ji-ni1
(1. College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China; 2. Husbandry Technology Promotion Center of Fuping County, Fuping 711700, China)

A method was developed for the determination of free fatty acids (FFAs) in goat milk by gas chromatography (GC) without derivatization. The process includes three parts: the extraction of goat milk lipids, the separation of FFAs and the determination by gas chromatography. Firstly, the milk lipids were extracted with ethanol/ether/n-heptane, and then FFAs were isolated on an aminopropyl column. Finally, the FFAs were identified and determined by gas chromatography. The external standard method was applied to determine the recoveries of FFAs in the goat milk, which acted as the calibration coefficients of FFAs. The results showed that the recoveries of long chain FFAs were higher than those of short chain FFAs, especially for C2︰0and C4︰0with values of 23.9% and 78.5%, respectively. The recoveries were stable with relative standard deviations blew 0.04%.

goat milk; gas chromatography; solid phase extraction; free fatty acids

TS207.3

A

1002-6630（2014）16-0138-04

10.7506/spkx1002-6630-201416027

2013-11-22

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技項目（2013BAD18B00）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201103038）；陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（2014K01-17-05）

晏慧莉（1987—），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：395460304@qq.com

*通信作者：張富新（1962—），男，教授，博士，研究方向為乳品科學(xué)。E-mail：fuxinzh@snnu.edu.cn